Еще одним, хотя и косвенным подтверждением того, что Иван Федоров побывал в южнославянских странах, является экземпляр Острожской Библии, доныне хранящийся в сербском монастыре Раваница на Фрушской горе. На этом экземпляре есть вкладная надпись, выполненная киноварью, в которой говорится, что 1 декабря 1583 года некий «слуга» князя Острожского «предах сию Библию… обители пречестного Вознесения Господня монастыря, прозываемого Раванице в земле сербской». Хотя даритель не называет себя по имени, E. Л. Немировский, обнаруживший этот экземпляр, предположил, что им был Иван Федоров. Княжескими слугами или служебниками официально назывались многие сотрудники князя Константина Острожского, в том числе и Иван Федоров. Кроме того, на Ивана Федорова указывает и то, что надпись сделана киноварью, которую любили в Москве, а в южнославянских землях использовали крайне редко. Вряд ли первопечатнику пришло бы в голову посылать книгу в далекий монастырь, если бы он сам там не побывал и не завел знакомых среди братии.
Различные списки Библии были доставлены в Острог также из Рима, из чешских земель, но наиболее полный экземпляр — Геннадиевская Библия — был привезен Михаилом Гарабурдой из Москвы.
Острожский научно-литературный кружок проделал огромную текстологическую работу по подготовке издания Библии. Тексты, переведенные с латыни, были сверены с греческими, часть их переведена заново.
Для печатания Острожской Библии первопечатник отлил новые шрифты, вырезал новые гравировальные доски.
Поначалу редакционный совет намеревался украсить Библию сюжетными гравюрами на металле. Эта сложная, трудоемкая и очень дорогая техника в те времена еще редко использовалась в Западной Европе, а в Восточной была практически неизвестна. Первопечатник начал переговоры с немецким мастером — гравером из города Вроцлава Блазиусом Эбишем. Между ними было заключено соглашение, по которому Эбиш обещал «Ивану Хведоровичу, проживающему в Остроге русскому типографу ясновельможного воеводы Киевского Константина», «вырезать на медных пластинах как можно лучше, насколько сумеет, изображения к истории святой Библии соответственно последовательности эпизодов и глав в количестве ста пятидесяти». За работу он запросил 700 золотых, а кроме того, наниматель обязывался все время, что мастер будет работать, обеспечивать его самого, его семью и подмастерьев питанием.
Предполагалось, что Эбиш приедет во Львов ко дню святой Агнешки — 21 января 1579 года, — когда в городе устраивалась традиционная ежегодная ярмарка. Однако этот приезд был отменен, и Острожская Библия вышла без гравюр немецкого мастера. Почему издатели Библии отказались от первоначального замысла — неизвестно. Высказывались предположения, что плата, запрошенная Эбишем, показалась им слишком высокой. Однако издание финансировал князь Острожский, а для него уплатить 700 золотых не представляло никаких затруднений. Более вероятно, что у издателей вызвала сомнение сама идея оформить Библию сюжетными гравюрами. Возможно, они решили, что такое нетрадиционное для русских книг оформление, к тому же выполненное мастером-немцем, сделает Библию похожей на лютеранскую, и решили не рисковать. Острожская Библия была оформлена традиционными орнаментальными гравюрами-заставками на дереве работы самого Ивана Федорова.
В период подготовки Библии в жизни Ивана Федорова произошла непонятная и неприятная история.
14 мая 1577 года знакомый первопечатника, известный краковский врач Мартин Сенник, автор книг «Испытание лекарств», «Гербарий, или Описание здешних, иностранных и заморских трав, какую силу они имеют, и как ими пользоваться», послал во Львов ремесленнику Власу Замочнику письмо, в котором сообщал, что Иван Федоров должен был оставить Власу Замочнику и Семену Седляру 600 золотых для пересылки в Краков автору письма. «Вероятно, — писал Мартин Сенник, — он знал, что я на святого Станислава (8 мая) теперь уже прошедшего, должен был принимать гостей, которые по его надобности приехали из немцев на ту ярмарку. А так как посланная мне сумма от пана Ивана не дошла, а гости сами по моей просьбе, и полагаясь на мое слово, приехали, должен был я за собственный счет их вознаградить и в том понес немалый убыток».
Иван Федоров и Семен Седляр были вызваны в суд.
Иван Федоров «под присягой, подняв два пальца к небу, публично признал и сказал, что он дал 50 золотых Сеньке Седляру с тем, чтобы тот передал их краковскому бумагоделательному мастеру Лаврентию через доверенного Мартина Сенника, однако по причине слухов о татарском набеге доселе не выслал их и сберегает у себя». О 600 золотых «он с удивлением узнал из прочитанного письма». Первопечатник показал также, что «ничего не знает про каких-то людей из Германии, которые должны были прибыть в Краков по его делу». Никаких купцов из Германии он не приглашал и денег Сеннику не обещал. То же показал Семен Седляр, сказав, что сам он Мартина Сенника никогда не встречал.
На этом дело и закончилось. Я. Д. Исаевич высказал предположение, что эта история как-то связана с переговорами Ивана Федорова с Эбишем. Однако кто был виноват в недоразумении, из-за которого почтенный краковский врач «понес немалый убыток» и, вероятно, навсегда рассорился с первопечатником — неизвестно.
В работе над Библией принимал участие и сын Ивана Федорова — Иван Друкаревич, как называли его по отцу, или Иван Переплетчик — по ремеслу, которое он к тому времени освоил. Иван Друкаревич женился на дочери львовского горожанина Татьяне Анципорковне и в 1580 году с молодой женой переехал к отцу в Острог. Вероятно, Иван Друкаревич, несмотря на молодость, был искусным мастером, поскольку ему первопечатник поручил переплетать Острожскую Библию.
Острожская Библия вышла в свет в августе 1581 года. Ее издание часто называют издательским подвигом Ивана Федорова.
Выход в свет первой полной славянской Библии был делом огромного общественного значения. E. Л. Немировский пишет: «Острожская Библия сыграла исключительно большую роль в истории культуры восточнославянских народов. В свое время она явилась для Запада своеобразным свидетельством идеологической и нравственной зрелости русских, украинцев и белорусов. Перевод Библии на национальный язык и издание ее на этом языке говорили о росте национального самосознания, укрепления позиций родного языка».
Острожская Библия представляет собой книгу большого формата, состоящую из 628 листов с текстом, размещенным в два столбца. На обороте титульного листа помещены герб князя Острожского и торжественные, по-старинному тяжеловесные вирши, сочиненные Герасимом Смотрицким. Восхваляя князя Острожского как инициатора издания Библии, Смотрицкий подчеркивает значение этого издания в деле сохранения национальной самобытности и борьбы против католической экспансии:
