было сложной задачей из-за высокой скорости кристаллизации. Вот почему необходимым условием стало требование, чтобы толщина живых объектов не превышала 0,3 мм, причем содержание в них воды должно составлять не более 50 %. При более высоком содержании воды толщина объектов должна быть еще уменьшена. В большинстве проведенных опытов объектами служили или одноклеточные организмы, или тонкие листья растений. Культуры из одноклеточных организмов наносили тонким слоем на поверхность пластинки слюды толщиной 0,01 мм. Пластинку погружали в жидкий воздух, где микроорганизмы мгновенно замерзали. Размораживание осуществляли, перенося объекты в нагретый до 40 °C изопентан (жидкость, которая не смешивается с водой). При проведении некоторых опытов применялась нагретая ртуть, а при опытах с листьями растений и вода. Иногда объекты погружали даже в кипящую воду на 0,2 с, после чего немедленно переносили в холодную воду.
Весьма подходящий объект для опытов был найден американскими исследователями братьями А. и С. Гётцами в 1938 г. Они использовали обыкновенные дрожжи. С помощью кольца из платиновой проволоки они отделяли тонкую пленку с культурой дрожжей, при этом объект оказался достаточно тонким, чтобы его можно было охладить с большой скоростью. Погрузив пробу в изопентан при температуре -190 °C, ее переносили в бензиловый эфир, подогретый до комнатной температуры. Таким образом осуществлялось быстрое размораживание. Затем к культуре добавляли каплю водного раствора красителя (метиленового синего), который окрашивал только мертвые дрожжи. Применяя такой способ, можно было под микроскопом пересчитать погибшие клетки, а их оказалось тем больше, чем медленнее проводилось замораживание и последующее размораживание. Это объясняется увеличением возможности кристаллизации воды в клетке. Время, которое дрожжи находились в замороженном состоянии, не оказывало влияния. При одних и тех же условиях замораживания и оттаивания количество погибших клеток и после сточасового, и после пятиминутного замораживания было одно и то же. При самых благоприятных обстоятельствах количество оживающих клеток достигало 20 %. Разумеется, в природе такое быстрое охлаждение невозможно. Там всякое охлаждение сопровождается образованием льдинок, в теле организма.
В 1940 г. советский ученый А. Е. Крисе обнаружил спороносные и неспороносные микроорганизмы только на поверхности замерзшего слоя почвы.
В более поздних исследованиях (1948 г.) известный советский ученый П. Ю. Шмидт снова изучал анабиотическое состояние при замораживании, насекомых и некоторых животных с постоянной температурой тела. Он пришел к заключению, что в первый период после фазы переохлаждения не наступает полное замерзание организма, а начинают только появляться кристаллы в жидкостях и клетках организма. Следовательно, и анабиоз возможен только при условии, которое исключает полное замерзание всех клеток.
Позже, в 1949 г., А. Крисе вместе со своим соотечественником Т. Граве сообщил об исследованиях проб льда, полученных из зоны вечной мерзлоты, в результате которых установлено, что эти пробы не содержали микроорганизмов. По мнению исследователей, для окончательного выяснения вопроса о наличии микробов, находящихся в состоянии анабиоза в почве зон вечной мерзлоты, необходимы дополнительные опыты.
В 1947 г. советский ученый А. В. Каляев, соблюдая все правила асептики, исследовал ряд проб почвы, взятых в зонах вечной мерзлоты. Он установил, что пробы, полученные с больших глубин, содержали только спороносные микробы, а те, которые были взяты с более поверхностного слоя, — и неспороносные микробы. Исследования А. В. Каляева окончательно доказали, что микроорганизмы могут продолжительное время сохраняться в почве зоны вечной мерзлоты в анабиотическом состоянии.
Советский ученый Э. Я. Граевский за период с 1946 по 1948 г. подверг воздействию сверхнизких температур (-172 °C) животные и растительные объекты, такие, как амебы, сперматозоиды (лягушек, крыс и собак), а также чешуйки лука и культуры микробов. Исследователь установил, что после воздействия низких температур сперматозоиды лягушек, чешуйки лука и культуры микробов сохраняли свою жизнеспособность. При очень низких температурах в клетках не образовывались кристаллы, так как их цитоплазма тотчас же переходила в аморфное состояние, минуя фазу кристаллизации благодаря мгновенному воздействию холода.
Интересные исследования над насекомыми при воздействии низких температур провел в 1955 г. советский ученый Л. К. Лозина-Лозинский. Проделанные им опыты показали, что при температуре -4,5 °C далеко не все жидкости тела насекомых затвердевают. Кроме того, некоторые, хотя и очень слабые, процессы обмена веществ продолжают осуществляться даже и при более низких температурах. До этого почти все исследователи утверждали, что организм насекомых не способен выдержать полного замораживания, чтобы затем снова вернуться к жизни. Это объясняли его сравнительно сложным устройством. Опыты Л. К. Лозина-Лозинского доказали, однако, что даже и среди таких сложно устроенных организмов, как насекомые, возможны исключения. Он исследовал гусеницы кукурузной моли. Они оказались весьма устойчивыми по отношению к низким температурам. Эти гусеницы проводят зиму в полом стебле кукурузы и в естественных условиях могут выдерживать очень низкие температуры. Ученый поместил гусениц в сосуд с твердой углекислотой при температуре -80 °C. Уже через 20 мин температура гусениц достигла -78,5 °C, они стали совсем твердыми и, падая сверху в фарфоровую чашку, издавали звон, как будто превратились в стеклянные шарики. После того как охлаждение было прекращено, гусениц положили на вату и начали постепенно обогревать. 50 % из них ожили. В другом опыте гусеницы находились несколько дней при температуре -30 °C, а затем одни сутки при температуре -80 °C. Часть из них тоже ожила. При таких низких температурах можно считать, что вся свободная вода в теле животных превратилась в лед. Едва ли можно предположить, что в них происходили какие-нибудь процессы обмена веществ. Однако этот вопрос нельзя считать вполне решенным, так как опытным путем было установлено, что у морозоустойчивых насекомых даже при температуре -20 °C совершается какой-то, хотя и очень слабый, газообмен.
Как видно из приведенного исторического обзора, изучение этого интересного биологического явления занимало умы многих ученых начиная с начала XVIII в. и до наших дней.
Сегодня известно, что многие растительные и животные организмы при неблагоприятных условиях (замороженные или высушенные) существенно замедляют или даже полностью прекращают обмен веществ[3], развитие и размножение, но, несмотря на это, не погибают. При благоприятных условиях они снова восстанавливают процессы жизнедеятельности. В состоянии анабиоза живые организмы переносят сильный мороз и жару, высокое давление, глубокий вакуум, мощную радиацию, вибрации и т. п.
Что означают термины анабиоз, гипобиоз, диапауза, покой, гипотермия, гибернация, эстивация, летаргия, криобиология и криомедицина?
В своем эволюционном развитии многие растительные и животные организмы приобрели своеобразные механизмы приспособления, чтобы иметь возможность пережить неблагоприятные сезоны года. В эти периоды условия их жизни резко ухудшаются в связи с нехваткой пищи, исключительно низкими или высокими температурами, высокой влажностью или засухой и пр. Многие организмы погибли бы, если не обладали бы совершенными физиологическими механизмами приспособления. Речь идет о возможности впадать в состояние продолжительного бездействия и покоя, наблюдаемого у многих животных и растительных организмов. У различных видов это состояние осуществляется своеобразно, разными способами, в зависимости от степени эволюционного развития животного или растительного организма и обозначается разными наименованиями. Чтобы многие научные понятия стали ясными, остановимся на часто используемых в научной литературе терминах и соответствующих им синонимах в популярном изложении.
Как уже говорилось, первые исследователи этого загадочного для прошлых времен явления (Левенгук, Спалланцани и др.) использовали понятие «скрытая жизнь», «мнимая смерть», «вита минима» (минимальная жизнь), «оцепенение», «бессознательное состояние», «безжизненность», «асфиксия» и другие и они рассматривали состояние возвращения к жизни как воскрешение.
Позже, в 1873 г., немецкий ученый Прайер, изучая явления возвращения к жизни после высушивания коловраток, тихоходок и нематод, пришел к выводу, что все представления, трактующие явления оживления этих организмов и их состояние при высушивании, Не соответствовали действительности. Состояние высушивания этих микроорганизмов и их способность возвращаться к жизни Прайер предложил назвать анабиотическим, а само явление — анабиозом (от греческого ana — обратно и bios — жизнь), т. е. возвращение к жизни, оживание.
