Многочисленные и разнообразные нарушения, вызываемые этой заменой одной аминокислоты, схематически представлены на рис. 7-2. Глядя на этот рисунок, нетрудно понять, что неосведомленный человек, рассматривая схему снизу, может истолковать сам синдром совершенно иначе, чем если бы ему была известна первопричина всех этих нарушений.
Рис. 7-2. Плейотропные эффекты замены одной аминокислоты в β-цепи гемоглобина Homo sapiens, которая приводит к развитию серповидноклеточной анемии (Strickberger, 1976).
Сталкиваясь со сложным фенотипом, образовавшимся к концу ветвящегося и переплетающегося своими ветвями онтогенетического пути, необходимо помнить о существовании дихотомии. Геном можно теоретически разделить на две части. Одна его часть состоит из тех генов, которые определяют так называемые жизненно важные (housekeeping) функции, а другая - из генов, непосредственно участвующих в детерминации, дифференцировке и морфогенезе. Жизненно важные функции - это те обычные метаболические процессы и процессы поддержания жизнедеятельности клетки, которые, хотя и не участвуют прямо в морфогенезе, создают биохимические условия, абсолютно необходимые для жизни. Мутантный индивидуум, у которого отсутствует одна из транспортных РНК (тРНК) или ДНК-полимераза, встречается с серьезными морфогенетическими проблемами. Однако такого рода нарушения основного метаболизма не обязательно затрагивают какой-нибудь конкретный орган, ткань или стадию развития. Такие мутанты следует отличать от тех, которые оказывают прямое воздействие на развитие.
Прежде чем можно будет прийти к каким-то определенным выводам о природе генетических дефектов, необходимо затронуть еще два очень важных момента. Первый из них касается первичного места действия данного гена. Иными словами, существует ли некая специфичная ткань или орган, в которых ген проявляет свою активность? Более того, автономен ли ген в своей активности? Этот вопрос связан с тем, что на самом деле существует плейотропия двух типов: 1) в случае относительной, или зависимой, плейотропии, как при описанной здесь серповидноклеточной анемии, существует одно первичное место действия гена (т. е. эритроциты), а все остальные наблюдаемые нарушения связаны с этим одним дефектом или возникают как его следствие; 2) в случае прямой, или истинной, плейотропии все разнообразные дефекты, возникающие в различных тканях и/или органах, вызываются непосредственным действием одного гена. Грюнберг (Grunberg) на основании своих исследований мутаций у мышей считал преобладающим типом относительную плейотропию. Однако известны также примеры прямых плейотропных эффектов.
Второй момент, который необходимо учитывать при любом серьезном обсуждении генетической регуляции развития, - это время, когда данный ген осуществляет свою активность. Когда начинается эта активность, продолжается ли она непрерывно, занимает ли она один дискретный интервал времени или несколько таких интервалов? Для ответа на этот сложный вопрос необходимо, конечно, установить характер продукта изучаемого гена.
Анализ времени и места действия генов
Методы, используемые для определения первичного места действия гена, сходны с применяемыми в классической эмбриологии и, в сущности, заимствованы из нее. В своей простейшей форме эти методы состоят в пересадке органа или кусочка ткани от мутантной особи нормальному реципиенту. Производят также и реципрокные пересадки. Эта операция обычно проделывается до проявления того или иного мутантного эффекта. Затем можно определить судьбу развивающегося органа или ткани в их новом окружении. Если генетический дефект рассматриваемого органа или ткани автономен для этой структуры, т. е. если она является первичным местом действия данного гена, то следует ожидать, что мутантная ткань будет продуцировать аномальный фенотип (даже и у нормального хозяина). Эксперименты сходного типа можно проводить на тканях или органах, выращиваемых в культуре, примерно таким же образом, как в описанных в гл. 5 экспериментах по совместному выращиванию дермы и эпидермиса мыши, ящерицы и курицы, только вместо соединения тканей от животных разных видов соединяют ткани или органы мутантных и немутантных особей.
Создание мозаичных особей проводилось в еще более широких масштабах Минц (Mintz) и ее сотрудниками. Этим исследователям удалось сращивать in vitro целых мышиных зародышей на стадии морулы. Таких «гибридных» зародышей имплантируют затем псевдобеременной самке. Получающиеся в результате мыши, происходящие от четырех родительских особей, состоят из смеси клеток двух разных генотипов, причем активны оба генотипа. Этот метод можно также использовать для анализа автономности экспрессии мутантных генов, сращивая мутантных и нормальных зародышей на стадии морулы.
Следует упомянуть еще об одном методе такого типа - о парабиозе. Он состоит в сращивании целых животных, а не просто органов или тканей. Необходимо указать, однако, что при таком сращивании не получается действительно интегрированных мозаичных особей. При всех этих методах необходимо, чтобы трансплантируемые ткани, органы или сращиваемые зародыши были совместимы. У низших позвоночных, таких как амфибии, это не представляет серьезной проблемы; однако у млекопитающих дополнительное осложнение возникает в связи с возможностью отторжения трансплантата, так что следует сначала убедиться в том, что мутантная и нормальная особи иммунологически совместимы.
Остается привести еще два метода, специфичные для генетики развития и применяемые почти исключительно при работе с Drosophila melanogaster. Это создание гинандроморфов и индукция мозаичных особей путем митотической рекомбинации. Гинандроморфами называют взрослых мух, тело которых состоит как из мужских, так и из женских тканей. Используя тип дробления, характерный для двукрылых, и их особую кольцевую Х-хромосому, таких мозаичных особей можно постоянно получать в лабораторных линиях. В норме X-хромосома дрозофилы имеет форму палочки, на одном конце которой находится центромера. Одна из мутантных форм этой хромосомы представляет собой замкнутое кольцо. Кольцо это обладает интересной особенностью: при нескольких первых делениях дробления оно нестабильно. Эта нестабильность может привести, в частности, к утрате кольцевой хромосомы одним из двух дочерних ядер, образующихся при первом делении дробления. Если утрата происходит на этой стадии, то в результате дальнейших делений дробления создается популяция ядер, одна половина которых содержит кольцевую Х-хромосому, а другая не содержит ее. Если зигота, начиная делиться, представляет собой гетерозиготную самку - палочка-Х/кольцо-Х, то после такой утраты половина ее ядер окажется женскими и будет содержать две Х-хромосомы - кольцо-Х/палочка-Х, а другая половина - мужскими и будет содержать только одну Х-хромосому - палочка-Х/О (пол у дрозофилы определяется соотношением Х-хромосом и аутосом, а не Y-хромосомой, как у млекопитающих). После восьми синцитиальных делений в яйце образуется скопление ядер. Это скопление, однако, не представляет собой случайной смеси типов ХО и XX. Ядра этих двух типов образуют две пространственно разделенные группы, расположение которых определяется плоскостью первого деления дробления. Поэтому, когда такая популяция ядер мигрирует к периферической цитоплазме, с тем чтобы образовать клеточную бластодерму, она мигрирует в виде двух соприкасающихся, но обособленных групп мужских и женских ядер. Взрослая муха, развивающаяся из такого гинандро-морфного зародыша, также будет мозаичной. Как показано на рис. 7-3, количество и расположение взрослой ткани мужской или женской природы непостоянно. Это происходит потому, что плоскость первого деления дробления располагается случайным образом по отношению к осям яйца. Поэтому если плоскость первого дробления делит яйцо по длинной оси на правую и левую половины, то из него разовьется билатеральный гинандроморф. Вариации этого простого случая приведут к большей или меньшей доле мужской ткани в зависимости от того, сколько ядер ХО находится в тех участках бластодермы, которым суждено сформировать взрослые ткани. Если мутантный ген локализован в X-хромосоме, то его эффекты можно проанализировать в мозаичной особи просто при помощи палочковидной Х-хромосомы, содержащей мутантный аллель (рис. 7-3). У образующегося в результате гинандроморфа часть клеток будет иметь нормальный женский генотип XX, а остальные клетки - мутантный мужской генотип ХО.
Рис. 7-3. Образование гинандроморфов у Drosophila melanogaster. Утрата нестабильной кольцевой Х-хромосомы при одном из ранних делений дробления приводит к образованию двух генотипически различных популяций ядер: XX (темные кружки) и ХО (светлые кружки). Если в клеточной бластодерме эти две популяции разделены по среднесагиттальной плоскости, то образуется мозаичная взрослая муха, у которой одна половина имеет мужскую, а другая - женскую морфологию. Если некольцевая Х-хромосома несет рецессивные гены-маркеры, то они экспрессируются в мужской ХО-половине. На это указывают укороченное крыло и белый глаз (муха в ряду А). Две мухи в нижнем ряду иллюстрируют результаты утраты кольцевой Х-хромосомы, за которой следует разделение либо в передне-заднем (Б), либо в косом (В) направлении (Strickberger, 1976).
