В 2014 и 2015 годах сообщалось, что в целом генетические инструкции, переписанные с «рецептов» ДНК в послания РНК, различаются между клетками двухклеточного эмбриона [23]. Эти исследования подтвердили, что только одна из двух клеток действительно тотипотентна, то есть способна развиться в мышь, как впервые было показано в экспериментах Энн Макларен и Джинни Папайоану.
С помощью такой высокочувствительной методики мы могли выяснить, какие гены последовательно используются в клетках, склонных развиваться в собственно эмбрион, а какие — в клетках, формирующих трофэктодерму, а затем сравнить полученные данные. К тому времени Мария-Елена, занятая решением других задач, вынуждена была переехать в Германию в лабораторию в Мюнхене. Но у меня уже был новый аспирант, Мубин Гулам из Южной Африки, любознательный и, что важно, полный энтузиазма пересмотреть весь этот затянувшийся спорный вопрос.
Мубин помнит, как ему часами приходилось наблюдать за каждым отдельным эмбрионом, пока тот дробился поздно ночью, переходя от двухклеточной стадии к четырехклеточной. Затем надо было изолировать каждую клетку. И если бы хоть одна оказалась повреждена, «пришлось бы уничтожить весь эмбрион». Несмотря на трудности, это время ему запомнилось как захватывающее [24].
Нам снова предстояло много работы, требующей тщательного выполнения, наряду с экспериментами, которые могли продолжаться с вечера до следующего утра. По моей просьбе Мубину пришли на помощь два превосходных эмбриолога: Агнешка Едрусик родом из Польши и Сара Грэхем из Новой Зеландии, которые когда-то готовили диссертации на базе моей лаборатории, после чего остались в ней работать. Я же, со своей стороны, купила в офис кофеварку и диван, на котором можно было спать.
Вычислительным анализом данных занималась лучшая группа во всем Кембридже команда Джона Мариони из соседнего Европейского института биоинформатики и, в частности, Антонио Шиалдоне [25]. Анализируя каждую клетку четырехклеточного эмбриона, Антонио обнаружил множество генов, значительно отличающихся своей активностью. Их было слишком много для исследования. Ему пришла в голову гениальная мысль сосредоточиться лишь на тех, что были мишенями для двух ключевых и уже изученных факторов транскрипции, ОСТ4 и SOX2, регулирующих активность генов, критически важных для клеточной потентности и гибкости. Мы могли продемонстрировать разницу в паттернах активности таких генов.
Обнаружив множество генов-мишеней, мы для начала сфокусировались на одном, кодирующем транскрипционный фактор SOX21, и сделали это не без причины. Во-первых, фактор SOX21 использовался как раз на четырехклеточной стадии, а во-вторых, клетки на этой стадии производили его в разных количествах.
Для проверки функций SOX21 Мубин создавал эмбрионы, клетки которых обладали либо повышенным, либо пониженным уровнем этого фактора. Клетки с измененным уровнем SOX21 он промаркировал, чтобы иметь возможность проследить их судьбу. Оказалось, что SOX21 при дифференцировке в трофэктодерму регулирует экспрессию другого ключевого фактора транскрипции, CDX2. Именно ему посвящалась докторская диссертация Агнешки, и мы много знали о его роли благодаря работе как нашей, так и других научных команд [26].
Мубин обнаружил, что высокий уровень SOX21 склонял клетки развиваться в эпибласт, поскольку приводил к снижению уровня CDX2. И наоборот, низкий уровень SOX21 приводил к повышенной экспрессии CDX2, склоняя клетки на постройку трофэктодермы. Примечательно, что на уровень экспрессии SOX21 влияла активность фермента CARM1 — того самого, который мы раньше изучали с Марией-Еленой.
Наконец-то мы раскрыли механизм, сдвигающий онтогенетический потенциал клеток четырехклеточного эмбриона, — механизм, который объяснял, почему клетки на очень ранней стадии не идентичны друг другу.
Хотя открытие было поразительным, нашу статью приняли не сразу. Одному из трех анонимных рецензентов не понравилось, что мы опять затронули концепцию неидентичности клеток на заре жизни мышиного эмбриона. Редактор журнала, тем не менее, остался непредвзятым и перенаправил нашу рукопись со всеми комментариями рецензентов и нашими на них ответами одному очень уважаемому эксперту, который, как нам сказали, не принимал участия в прежних дебатах и мог судить беспристрастно.
Мы понятия не имели, кем был этот независимый эксперт, но, к нашему облегчению, ему понравилась наша работа, и он рекомендовал статью к публикации. После столь долгого для меня и моих коллег пути мы отпраздновали новость большим количеством шампанского. Исследование было опубликовано в 2016 году в престижном журнале Cell [27].
Невероятно, но в том же мартовском номере Cell вышла еще одна статья с аналогичными выводами. Группа из Института молекулярной и клеточной биологии при Агентстве науки, технологии и исследований[15] в Сингапуре, возглавляемая Нико Плахтой, творчески подошла к изучению взаимодействий ДНК и транскрипционных факторов клеток четырехклеточного эмбриона. Они узнали, что в индивидуальных клетках SOX2 связывается с ДНК в разные периоды и что продолжительность этой связи коррелирует с судьбой клеток. Следовательно, по длительности связи SOX2—ДНК можно предсказать судьбу клеток на четырехклеточной стадии развития. Изумлял и тот факт, что Нико установил зависимость связи SOX2—ДНК от активности фермента CARM1, которая у клеток четырехклеточного эмбриона была вовсе не одинаковой [28].
Выполненная группой Нико красивая и замысловатая работа поведала все ту же историю о том, что клетки мышиного эмбриона не идентичны друг другу и их судьба на четырехклеточной стадии развития подвластна активности фермента CARM1 [29]. Тот самый номер журнала Cell содержал комментарий по поводу обеих статей и их актуальности, написанный Хуаном Карлосом Исписуа Бельмонте — главой лаборатории регуляции экспрессии генов в Институте Солка (Ла-Хойя, Калифорния) и автором впечатляющей работы по программированию и перепрограммированию клеточной судьбы.
Накопленные доказательства подтверждали гипотезу о том, что клетки и в самом деле отличаются уже на очень ранней, четырехклеточной, стадии развития эмбриона. Понадобилось много времени, но мы наконец-то поняли принципиальные основы того, как возникают первоначальные уклоны и выступают движущей силой, шаг за шагом очерчивающей судьбы клеток на заре жизни.
Как сделать близнецов
С тех пор как мы обнаружили доказательства уклона в онтогенетическом развитии, нам захотелось узнать, как этот уклон может быть настолько сильным, что лишь одна из двух клеток, разделенных на двухклеточной стадии, развивается должным образом? Связано ли это с генерацией плюрипотентных клеток в организме?
Выдающийся британский биолог Льюис Уолперт часто спрашивал меня: сколько плюрипотентных клеток нужно при имплантации, чтобы беременность была успешной? Определенно для создания мыши требуется минимальный набор клеток, но какой именно?
Ответ, как это бывает в науке, пришел неожиданно в ходе экспериментов с видеовизуализацией, проводимых Сэм Моррис из моей команды. Сэм разделила клетки двухклеточного эмбриона и оставила их развиваться в половинчатые бластоцисты. После подсчета количества эпибластных клеток в каждой из близнецов-бластоцист Сэм перенесла их в матку приемных матерей. Это был ответ на вопрос Льюиса: чтобы получился мышонок, при имплантации нужны как минимум четыре плюрипотентные клетки. Если на двухклеточной стадии отделить две клетки друг от друга, только одна сможет генерировать это количество, а ее сестра — нет.
Сэм продвинулась еще дальше. Она задалась вопросом: какая из двух клеток может, а какая не может совершить этот онтогенетический подвиг превращения в индивидуум? Чтобы ответить на вопрос, она создала химеры из того же типа клеток, который когда-то использовала Каролина. Оказалось, что клетка, не развивающаяся после разделения со своей сестрой, — это та самая клетка, которой суждено стать вегетативной на четырехклеточной стадии, своего рода материнская клетка вегетативной клетки.
