Наш сумасшедший проект
Тот период совпал с первым годом скитания Сары Харрисон по разным лабораториям, где она выполняла краткосрочные проекты, прежде чем выбрать тему докторской диссертации. Сара подошла ко мне и спросила, могу ли я стать ее научным руководителем. Я с радостью согласилась и попросила ее помочь осуществить мою мечту — создать эмбрионоподобную структуру in vitro из разных типов стволовых клеток. У Сары было полно энтузиазма, сообразительности и амбиций, чтобы взяться за что-то трудное, но значительное. Зная, что прошу многого, я обещала всестороннюю поддержку на протяжении всего ее пути, который, как я подозревала, мог оказаться извилистым.
Под конец первого года работы над диссертацией Сара научилась имитировать с помощью ЭС-клеток первые этапы развития, а именно — поляризацию и люменогенез (Иван к тому времени покинул лабораторию, чтобы собрать собственную команду в Институте Макса Планка в Германии). Затем она продвинулась на шаг дальше и уже наблюдала, как клетки этих структур активируют ген Brachyury, экспрессия которого знаменует нарушение симметрии и обособление мезодермы. И все бы ничего, однако экспрессия Brachyury в ее синтетических эмбрионах была неорганизованной — происходила в случайных местах и совсем не так, как в естественных эмбрионах, у которых экспрессия этого гена всегда происходит между эмбриональной и внеэмбриональной тканями и на одной стороне эмбрионально-внеэмбриональной границы, то есть асимметрично.
Пока мы думали, что же предпринять с первыми результатами Сары, наши соседи из кембриджского отделения генетики во главе с Альфонсо Мартинесом Ариасом опубликовали статью с похожими выводами [11]. Их подход отличался от нашего. Вместо того чтобы начать с небольшого количества ЭС-клеток, формирующих розеточную структуру с открывающейся затем полостью, как у эмбрионов, они начали с сотен ЭС-клеток, создающих эмбриоидное тело, как в оригинальном исследовании Дерка тен Берга и Роэля Нуссе из Стэнфорда [12]. Такой подход тоже индуцировал экспрессию Brachyury, но, как и в нашем эксперименте, без настоящей гаструляции. Хотя методики были разными, итоговый смысл был схож с нашим. Многим исследователям было бы очень обидно наблюдать, как другая команда публикует их исследование. Но только не Саре.
Мы не стали писать еще одну научную статью с похожими результатами, а решили сделать глубокий вдох и предпринять следующий шаг. Он заключался в том, чтобы воссоздать структуру эмбриона с помощью всех компонентов, тем самым позволив ЭС-клеткам сотрудничать с ТС- и XEN-клетками — стволовыми клетками, происходящими из трофэктодермы и примитивной мезодермы, как мы и планировали изначально. Мы надеялись, что в результате экспрессия Brachyury будет организованной, а не стохастичной.
Однако создать успешный союз между разными типами стволовых клеток in vitro проще на словах, чем на деле. Поначалу мы, коротко говоря, не смогли заставить все клетки расти в одной среде и «договариваться» между собой. Но позже нам действительно удалось подтолкнуть ЭС-клетки к сотрудничеству с ГС-клетками, поместив их во внеклеточный матрикс из матригеля. Этот матрикс важен, поскольку заменяет собой третий недостающий тип ткани, примитивную энтодерму, ведь именно она индуцирует первый критический шаг самоорганизации — поляризацию клеток.
Пошаговая сборка эмбриона
Если бы мы занимались настоящей клеточной инженерией, мы бы складывали эмбрион из отдельных клеток, как ребенок по кирпичику собирает конструктор Лего. Мы смешали в чашке Петри два типа ткани в разных концентрациях и позволили клеткам взаимодействовать в случайном порядке. На второй день проверка под микроскопом показала, что некоторые клетки и в самом деле начали взаимодействовать и собираться в структуры. Их было немного, так как они формировались за счет непредсказуемых встреч, но когда эти ЭС- и ГС-клетки объединялись, их самоорганизация была изумительной — они как будто знали, что им делать, и преследовали конкретную цель.
Глядя в микроскоп во мраке лабораторной комнаты, мы стали свидетелями многих фундаментальных процессов развития. Первым делом мы увидели поляризацию клеток. Следуя ей, стволовые клетки организовывали себя таким образом, чтобы ЭС-клетки скапливались на одном конце, а ГС-клетки на другом. Затем в пределах каждого скопления открывалась полость и, благодаря диалогу между эмбриональными (производными ЭС-клеток) и внеэмбриональными (производными ГС-клеток) компартментами, получалась трехмерная структура в виде восьмерки. Мы выяснили, что при этом происходит передача сигнала с помощью белка Nodal[19]. Две полости в итоге сливались в одну с образованием крупной, так называемой проамниотической полости, существенной для развития эмбриона. Казалось, что этот люминогенез был идентичен таковому в естественном эмбрионе вскоре после имплантации. Мы стали свидетелями потрясающего подвига самоорганизации.
Но, как всегда, нам захотелось пойти дальше и сделать так, чтобы идентичные клетки в ЭС-производной части эмбриона нарушили свою симметрию должным образом. Я имею в виду попытку гаструляции — критический шаг, закладывающий основы будущего плана тела.
Мы обнаружили, что, если позволить структурам из ЭС- и ГС-клеток развиваться чуть дольше, они действительно нарушают свою симметрию. Как и в естественных эмбрионах, на границе между эмбриональными и внеэмбриональными компартментами начинается экспрессия генов, таких как Brachyury. Ген Brachyury очень важен, поскольку играет роль в формировании мезодермы и передне-задней оси симметрии [13]. Увиденное заставило замереть мое сердце и повергло в трепет всю лабораторию.
Архитектура этих эмбрионоподобных структур была достаточно близка к естественному эмбриону, чтобы приоткрыть тайны его развития на стадии имплантации в теле матери. Было очевидно, что эти ЭС-плюс-ГС-структуры имитировали морфологию и паттерны эмбриона намного точнее, чем одни только ЭС-клетки, и служили гораздо более правдивой моделью развития.
В каком-то смысле эти два вида стволовых клеток напоминали танцоров, сообщающих друг другу, где им расположиться в пределах эмбриона. Без этого па-де-де правильное развитие очертаний и форм и своевременное задействование ключевых биологических механизмов было бы невозможным. Мы также обнаружили, что, как и при естественном развитии, эти паттерны контролируются сигнальными путями Wnt и BMP, Bone Morphogenetic Protein (костного морфогенетического белка).
Когда мы с Сарой увидели формирование первых структур, странноватых, но кажущихся совершенными, мы не поверили своим глазам. Я восхищалась ими тогда и восхищаюсь теперь, когда пишу эти строки. Той осенью я поставила большую часть своей личной жизни на паузу, сопоставляя полученные результаты и описывая их для статьи. Темп моей работы, наверное, сводил Сару с ума, ведь я требовала от нее больше экспериментов, больше проверок и так далее и тому подобное, чтобы убедиться, что мы ничего не упустили и верно истолковали все данные.
Сара была очень преданной и организованной. Но возникла одна чисто практическая проблема. Согласно одному из условий ее докторской программы, она должна была несколько месяцев поработать с промышленным партнером. Чтобы помочь Саре закончить работу, я попросила еще одну аспирантку из Университета Акдениз в Анталии (Турция) приехать ко мне в лабораторию.
Так к Саре присоединилась Берна Созен. Я думаю, что поступила правильно. Поначалу Берна собиралась пробыть в моей лаборатории всего один год, но этот опыт изменил ее жизнь, и Берна осталась с нами заниматься своими постдокторскими исследованиями.
Мы представили статью в журнал Nature. Ее отправили на рецензирование, что уже было хорошо, поскольку довольно много статей отсеивалось в самом начале. Редакторы были настолько опытными и осведомленными, что даже такое решение являлось важным одобрением с их стороны (поэтому мы устроили небольшой праздник — даже скромный успех имеет значение). Но в итоге нам сообщили, что примут работу только в том случае, если мы, по словам одного из рецензентов, предоставим подробные сведения обо всех генах, которые принимают участие в сборке синтетического эмбриона, а также об изменениях паттернов их экспрессии на каждой стадии самосборки. Грандиозная задача. К тому же у меня не было соответствующих технологий для изучения изменений паттернов экспрессии всех генов. Нужны были средства на покупку оборудования, которое я не могла себе позволить. Наконец, мне надо было найти сотрудников. И я нашла их, но не в Кембридже, а на другом конце планеты благодаря воскресной прогулке по Сиднею.
