Ранее мы обсуждали ген, кодирующий Cry-токсин, который производится бактерией Bacillus thuringiensis, – он делает растение устойчивым к вредителям. Как уже упоминалось, это одна из самых распространенных, изученных и экономически выгодных генетических модификаций. Ниже приведена нуклеотидная последовательность природного гена Cry-токсина в одном из бактериальных штаммов.
А вот аминокислотная последовательность белка, который кодирует этот ген.
Все последовательности находятся в свободном доступе, и любой специалист знает, где их найти. Обычный тест на наличие вставки в геноме организма заключается в поиске ее нуклеотидной последовательности в образце. Самый простой способ называется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Его часто представляют как точный и надежный подход для обнаружения трансгенных вставок247. Существуют и другие, но метод ПЦР в его различных вариациях – самый дешевый, широко используемый и признан большинством регулирующих организаций.
ПЦР – один из важнейших многофункциональных инструментов в руках биотехнолога. Он был разработан в 1984–1986 годах американским биохимиком Кэри Муллисом248 и принес своему изобретателю Нобелевскую премию. ПЦР позволяет в считанные часы размножить одну-единственную молекулу ДНК определенной последовательности до миллиарда копий.
Эта реакция стала возможной благодаря открытию бактерий, живущих в горячих источниках. ДНК-полимераза человека может достраивать вторую цепочку ДНК при температуре тела около 36 градусов. А вот у термофильных бактерий в результате эволюции появились ДНК-полимеразы, работающие при более высоких температурах, например при 72 градусах, и не разрушающиеся даже при очень высоких температурах порядка 95 градусов. Для проведения ПЦР нам понадобится именно такая термофильная полимераза, а также три чайника. В принципе можно было бы обойтись и одним чайником, а на практике и вовсе использовать программируемые термостаты, но так нам будет проще описать процедуру.
Для работы ДНК-полимеразы, кроме правильной температуры, необходимы следующие компоненты: выделенная из образца ДНК, предположительно содержащая фрагмент, который мы собираемся размножить, свободные нуклеотиды (а точнее дезоксинуклеозидтрифосфаты, но давайте не будем использовать точную терминологию), специальная буферная смесь, содержащая различные ионы, необходимые для работы фермента. Наконец, нужны особые затравки, праймеры, про которые придется сказать несколько слов отдельно.
Вот наш ген Cry-токсина. Но на этот раз запишем его в виде двух комплементарных цепей молекулы ДНК, одну под другой. Точки отображают пропущенный фрагмент середины гена.
В этой записи появились названия двух концов цепочки ДНК: 5’ и 3’. ДНК-полимераза умеет присоединять нуклеотиды только к 3’-концу строящейся цепочки молекулы ДНК. Кроме того, ДНК-полимераза не умеет синтезировать ДНК с нуля, ей нужна затравка (праймер), комплементарная 3’-концу уже имеющейся цепочки ДНК, которую предстоит удвоить. Полимераза начинает достраивать нужную цепь, прикрепляя нуклеотиды к 3’-концу праймера. В живых клетках праймеры состоят из РНК и синтезируются особой РНК-полимеразой (которой затравка не нужна). Но мы будем использовать ДНК-праймеры, которые синтезируют химически в лаборатории, путем последовательного присоединения нуклеотидов друг к другу. Праймеры подбираются таким образом, чтобы между ними находился анализируемый нами ген или его фрагмент. Нам понадобятся два типа праймеров, изображенные ниже (стрелки показывают направления достраивания цепочек ДНК).
Один праймер комплементарен 3’-концу левой части анализируемого фрагмента, а второй праймер комплементарен З’-концу его правой части. Концентрация праймеров должна быть высокой, зато исходного умножаемого фрагмента ДНК может быть хоть одна-единственная молекула.
Смешаем все вышеупомянутые компоненты вместе с праймерами и ДНК-полимеразой из термофильной бактерии в пробирке и вернемся к нашим трем чайникам. В первом чайнике мы будем поддерживать температуру порядка 95 градусов. При такой температуре молекула ДНК денатурирует: превращается из двухцепочечной молекулы в две одноцепочечные. Поместим туда нашу пробирку.
Во втором чайнике температура будет 58 градусов. Это оптимальная температура для специфичного присоединения наших праймеров, поэтому, когда мы поместим туда нашу пробирку со смесью, праймеры прилипнут к ДНК по принципу комплементарности.
В третьем чайнике у нас будет температура 72 градуса, идеальная для работы ДНК-полимеразы термофильных бактерий. Когда мы поместим нашу пробирку туда, полимераза достроит молекулу ДНК до двойной цепочки.
Была одна двухцепочечная молекула, а стало две. После этого мы снова помещаем пробирку в чайник при температуре 95 градусов, и цикл повторяется. Один цикл может занимать всего несколько минут, за час можно повторить все около двадцати раз, то есть увеличить концентрацию исходной молекулы в миллион раз. С обычной полимеразой, работающей при температуре 30–40 градусов, такая процедура не прошла бы по двум причинам. Во-первых, сама полимераза оказалась бы разрушена при высокой температуре, необходимой для разделения цепочек ДНК. Нам бы пришлось каждый раз добавлять полимеразу в реакционную смесь заново. Во-вторых, при низкой температуре праймеры будут прилипать не только к той цепи ДНК, с которой они полностью комплементарны, но и к похожим фрагментам, а значит, мы рискуем умножить не ту последовательность ДНК, которую хотели. Специфичность метода была бы намного ниже.
Высокую чувствительность метода ПЦР наглядно иллюстрирует история, опубликованная в журнале Nature™. Ученые из медицинского центра Маунт-Синай (США) использовали тройки нуклеотидов, чтобы закодировать цифры и буквы секретного послания. Зашифрованное на языке нуклеотидов сообщение поместили между определенными последовательностями ДНК, к которым у принимающей стороны были праймеры. Капельку раствора с содержащей послание ДНК, перемешанную с обычной человеческой ДНК, нанесли на простой бумажный текстовый документ и отправили его по почте. При этом количество ДНК с сообщением было ничтожным – как абсолютное, так и относительно количества “примесей". Представьте, что вам нужно найти одно-единственное предложение, спрятанное в одной из 170 миллионов книг Британской библиотеки. Примерно такую задачу предстояло решить адресату.
Принимающая сторона использовала ПЦР, чтобы обнаружить фрагмент ДНК с посланием и увеличить число копий этих молекул в миллиарды раз. После этого была установлена последовательность нуклеотидов послания, а само сообщение было расшифровано. Оно гласило “6 июня, вторжение, Нормандия”. Так было показано, что можно использовать молекулы ДНК в криптографии. За пятьдесят пять лет до этого исследования, в июне 1944 года, случилась высадка в Нормандии – скоординированная операция совместных сил США, Великобритании, Канады и их союзников против сил Германии во время Второй мировой войны. Криптография сыграла важную роль в успехе этой военной операции.
ПЦР позволяет обнаружить вставку только в том случае, если мы знаем с высокой точностью хотя бы два участка анализируемой последовательности, длиной примерно в двадцать нуклеотидов каждый. А значит, если переносимый ген достаточно сильно изменить, таким методом он обнаружен не будет. Чтобы неточный праймер присоединился к цепочке ДНК, необходимо снижать температуру во “втором чайнике", а это может привести к тому, что праймеры свяжутся неспецифично – с каким-то случайным участком ДНК, что, в свою очередь, приведет к ложноположительному результату.
Напомню, что в стандартном генетическом коде три нуклеотида в кодоне и четыре типа нуклеотидов позволяют закодировать 64 аминокислоты. Но генетический код кодирует лишь 20 аминокислот. Некоторые аминокислоты кодируются несколькими кодонами. Используя это свойство, я предложу нуклеотидную последовательность, которая не существует ни в одной базе данных и не существует в природе. Но тоже кодирует белок Cry-токсина, причем идентичный оригинальному. Вот она.
Ниже приведено сравнение исходной и полученной последовательности гена Cry-токсина. Подчеркну, что обе нуклеотидные последовательности кодируют один и тот же белок (хотя описанные изменения могут привести к небольшим изменениям количества производимого белка).
Если вы посмотрите на эти две последовательности, то заметите, что нет ни одного фрагмента ДНК длиной хотя бы в шесть нуклеотидов, который совпадал бы у исходной и новой нуклеотидной последовательности. Это означает, что методом полимеразной цепной реакции будет проблематично обнаружить присутствие такой вставки в геноме организма. Только что мы обманули существенную часть регулирующих инстанций и вывели на рынок ГМО под видом “органического" продукта. Трудно сказать, догадались ли так делать какие-нибудь компании. В принципе не проблема выяснить, какие праймеры используются для рутинных проверок на содержание ГМО (на самом деле часто ищут не сам ген, а другие, связанные с ним конструкции, например регулирующие его работу участки). Достаточно убедиться, что последовательности, подходящие под эти праймеры, в наших вставках отсутствуют.
