Ознакомительная версия.
9
Споры вокруг двойной спирали
В наше время слово «ДНК» стало столь же привычным, как «нефть» или «сталь». Вокруг ДНК царит обстановка бума: тысячи лабораторий, биотехнологических и фармацевтических компаний заняты производством «рекомбинантных ДНК», многотысячная армия специалистов манипулирует генами и ищет возможности практического приложения результатов этих манипуляций. А началось все с маленькой, на одну страничку, заметки в журнале Nature от 25 апреля 1953 года, подписанной двумя именами, мало кому известными в то время, – Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик.
В заметке излагалось мнение авторов о том, как устроена молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты. Сообщалось, что она состоит из двух антипараллельных полинуклеотидных цепочек, завитых в двойную спираль; что внутри двойной спирали находятся азотистые основания, образующие как бы начинку кабеля, а оболочка кабеля построена из отрицательно заряженных фосфатных групп. Азотистые основания из противоположных цепей образуют пары согласно принципу комплементарности: аденин (А) всегда против тимина (Т), а гуанин (Г) против цитозина (Ц) (рис. 38). Комплементарные пары скреплены водородными связями: двумя в случае А•Т-пар и тремя в случае Г•Ц пар. Пары оснований располагаются строго перпендикулярно оси двойной спирали, подобно перекладинам в перевитой веревочной лестнице.
Эта структура, которую, по всеобщему убеждению, ДНК имеет при физиологических условиях, получила название В-формы. Структура ДНК сильно меняется, только если молекулу поместить в совершенно необычные условия, скажем, в очень концентрированный раствор спирта (не в водку, а в гораздо более крепкое пойло, содержащее около 80 % спирта). Но в широком интервале внешних условий структура ДНК, как показывали многочисленные данные, оставалась практически неизменной.
Как это ни покажется странным, в течение продолжительного времени не было строгих доказательств, что ДНК – это действительно двойная спираль. Дело в том, что экспериментальные данные, на которых основывались Уотсон и Крик, а также те, кто шел за ними, не могут трактоваться вполне однозначно. Всегда остается, в принципе, возможность того, что тем же данным, в пределах экспериментальной точности, удовлетворит какая-то совсем другая структура.
В конце 1970-х годов, например, много шума наделала модель новозеландских и индийских ученых, согласно которой две цепи ДНК не переплетаются друг с другом, а идут параллельно бок о бок (ее так и назвали БОБ-форма).
Первоначально утверждалось, что БОБ-форма дает такую же рентгенограмму, как и В-форма. Когда выяснилось, что это не так, стали говорить, что, мол, в волокнах и кристаллах, где изучают ДНК методом рентгеноструктурного анализа, она, может быть, и находится в В-форме, а в растворе и уж подавно в клетке – в БОБ-форме. Большим преимуществом модели считалось отсутствие топологических проблем при репликации (не нужно расплетать закрученные в спираль комплементарные цепи). Несостоятельность БОБ-формы как модели ДНК при обычных условиях была показана многими методами. Однако возникшие вокруг этой модели споры оказались полезными. Они заставили придирчиво пересмотреть вопрос о том, насколько мы уверены, что модель Уотсона и Крика справедлива во всех главных чертах, а не только в том, что ДНК состоит из двух цепей и последовательности в них взаимно комплементарны.
Наиболее убедительные доказательства были получены в опытах с кольцевыми ДНК. Это было сделано все тем же Джеймсом Уонгом из Гарварда, имя которого нами не раз упоминалось. Уонг не только однозначно доказал, что ДНК представляет собой спираль, но и с высокой точностью определил число пар, приходящихся на виток двойной спирали В-ДНК в растворе. Эта величина оказалась равной 10,5, что очень близко к величине, постулированной Уотсоном и Криком. Опыты Уонга, однако, требуют довольно сложного анализа (любознательный читатель может ознакомиться с этим анализом, раздобыв одну из предыдущих версий этой книги: М. Д. Франк-Каменецкий «Самая главная молекула», М., 1988). Здесь мы ограничимся анализом не менее убедительных, но более доступных для понимания опытов Д. Шора и Р. Болдвина из Стэнфордского университета.
Шор и Болдвин занимались изучением вопроса о том, как зависит от длины ДНК вероятность ее замыкания в кольцо. Для этого они брали молекулы, имеющие липкие концы (о таких молекулах уже шла речь в главах 5 и 8), и добавляли фермент лигазу. О вероятности судили по выходу замкнутых кольцевых молекул. Сначала Шор и Болдвин ограничились природными молекулами, затем привлекли методы генной инженерии, что позволило исследовать очень короткие цепи, содержащие всего 200 пар. Поначалу получавшаяся картина радовала исследователей – она соответствовала теории и здравому смыслу. Для очень длинных молекул, содержащих много куновских сегментов, вероятность замыкания падала с ростом длины цепи. Наоборот, для коротких молекул вероятность падала с уменьшением длины. Это вполне понятно, так как длинные молекулы подобны траектории человека, заблудившегося в лесу (см. главу 3), а короткие подобны резиновой дубинке – чем короче дубинка, тем труднее ее согнуть в кольцо.
Одно обстоятельство смущало исследователей. По мере уменьшения длины резко увеличивался статистический разброс результатов, хотя опыты с короткими ДНК ставились не менее тщательно, чем с длинными. В чем дело? Чтобы разобраться в этой неприятной ситуации, Шор и Болдвин приготовили, используя методы генной инженерии, набор образцов, содержащих молекулы из 237, 238 и т. д. до 255 пар нуклеотидов. Когда они измерили для каждого препарата вероятность образования кольцевых цепей и нанесли их на график, то получили отрезок синусоиды с периодом в 10 пар. Стала ясна причина разброса точек. К разбросу приводили вовсе не случайные выбросы, а регулярные осцилляции, связанные со спиральным строением ДНК.
Чтобы понять результат этих важных опытов, представим себе, что мы имеем дело с кольцевой ДНК, одна из цепей которой порвана, и молекула предоставлена самой себе в растворе. Как будет выглядеть ситуация в месте разрыва? Может оказаться, что два конца разорванной цепи готовы к стыковке, как показано на рис. 39а. Но возможно и совсем неблагоприятное взаимное расположение концов, как показано на рис. 39б.
Рис. 39. Два предельных случая стыковки кольцевой молекулы ДНК в месте эдноцепочечного разрыва: а – удачная стыковка: б – неудачная
Представим себе теперь, что мы добавили ДНК-лигазу, которая залечивает разрывы. Фермент может сделать свое дело, только если разорванные края подходят друг к другу «стык в стык». Что же, он зашьет только такие молекулы, как на рис. 39а? Нет, не только. Дело в том, что молекула ДНК – это все-таки микроскопический объект. Одна из принципиальных особенностей микрообъектов, отличающая их от макрообъектов, к которым мы привыкли в повседневной жизни, состоит в том, что микрообъекты испытывают значительные изменения своей формы и размеров вследствие просто теплового движения. В нашем макромасштабе эти изменения незаметны, мы их просто не видим.
В свое время уже шла речь о том, что тепловое движение изгибает линейную ДНК, не дает ей вытянуться, как спице. Оно же не дает кольцевой ДНК принимать энергетически наиболее выгодную форму окружности. Молекула принимает в пространстве причудливую, постоянно меняющуюся форму. Кроме того, в результате теплового движения постоянно меняется угол поворота между соседними парами оснований в двойной спирали. Вследствие теплового движения в опытах Шора и Болдвина лигаза залечивала разрывы не только в случае идеальной стыковки, изображенной на рис. 39а, но и в неблагоприятном случае (рис. 39б), и во всех промежуточных ситуациях. Разница состояла лишь в том, что вероятность замыкания была максимальной в случае, изображенном на рис. 39а, и минимальной для случая, изображенного на рис. 39б. Синусоидальные изменения вероятности замыкания, следовательно, отражали вращение одного конца в месте разрыва относительно другого конца из-за спиральной природы ДНК при удлинении молекулы. Период этой синусоиды соответствовал периоду двойной спирали. Так Шору и Болдвину удалось наглядно продемонстрировать спиральное строение ДНК и оценить период спирали. В дальнейшем Д. Горовиц и Дж. Уонг определили из данных для коротких колец период спирали с очень высокой точностью. Он оказался равным 10,54, в полном соответствии с результатами опытов Уонга.
Замечательной чертой результата Уонга, так же как и опытов Шора и Болдвина, является то, что он получен для изолированных молекул в растворе. Ведь со времени классической работы Р. Франклин все сведения о детальной структуре ДНК основывались на рентгеновских данных для волокон, в которых молекулы сильно взаимодействуют друг с другом.
Ознакомительная версия.
