Ознакомительная версия.
Как удалось установить, тому, что изученный гексануклеотид оказался в Z-форме, способствовала главным образом строго чередующаяся последовательность Г и Ц.
Вскоре Р. Диккерсон и его сотрудники из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе определили структуру в кристалле ДНК другой последовательности:
Оказалось – В-форма. Стали изучать переход ДНК в Z-форму в растворе. Выяснилось, что при обычных условиях, по крайней мере в линейной ДНК, Z-форма не образуется. Ну а в сверхспирализованной?
Рис. 41. Так выглядят объемные модели Z– и В-формы ДНК. Черные линии нарисованы, чтобы показать ход сахарофосфатной цепи
Конечно, сверхспирализация должна делать Z-форму более выгодной, так как изменение знака спирали из положительного на отрицательный в отрезке ДНК снимает напряжение в остальной части отрицательно сверхспирализованной молекулы. Поэтому вполне естественно предположить, что в сверхспирализованной ДНК участки, имеющие чередующуюся последовательность Г и Ц, будут переходить в Z-форму. Так ли это?
Ответ на этот вопрос зависит от того, какова энергия перехода В – Z для участка, имеющего последовательность …ЦГЦГЦГЦГЦГ… Ведь помимо регулярной В-формы образование Z-формы должно стать более выгодным, чем образования креста, чтобы эта форма существовала. Ведь последовательность
это перевертыш, так что вопрос о том, переходят ли участки ДНК с подходящей последовательностью в Z – форму, совсем не прост. Его необходимо было исследовать экспериментально.
Как и в случае с крестами, наиболее эффективным методом выяснения вопроса о том, образуется ли Z-форма в отрицательно сверхспирализованной ДНК, оказался метод двумерного гель-электрофореза (см. главу 7). Только достаточно длинные участки …ЦГЦГЦГЦГ… в обычных плазмидах не встречаются. Поэтому потребовалось конструирование специальных плазмид, несущих искусственные вставки …ЦГЦГЦГЦГ… разной длины.
Дж. Уонг впервые применил к исследованию Z-формы метод двумерного гель-электрофореза. Исследуя плазмиды с длинными вставками …ЦГЦГЦГЦГ…, он наблюдал картинки типа приведенной на рис. 32 в условиях, когда для контрольной плазмиды, лишенной вставки, никакого разрыва на электрофореграмме не наблюдалось. Это означало, что наблюдаемый структурный переход происходил во вставке …ЦГЦГЦГЦГ… Но что при этом возникало – крест или Z-форма? Ответ на этот вопрос могла дать величина скачка, т. е. то, на сколько топоизомеров вверх происходил скачок при переходе. Если бы происходил переход в крест, то следовало ожидать скачок на т/10,5 топоизомеров, где т – число пар в перевертыше, т. е. в последовательности …ЦГЦГЦГЦГ… В случае же образования Z-формы следовало ожидать скачка на т (1/10,5 + 1/12,5) топоизомеров (12,5 – это число пар, приходящихся на виток левой спирали ДНК в Z-форме). Эксперимент дал четкий ответ – величина скачка отвечала образованию Z-формы, а не креста. Так было показано, что последовательности …ЦГЦГЦГЦГ… могут переходить в Z-форму в условиях, близких к физиологическим. Это позволяло надеяться, что Z-форма может возникать в ДНК внутри клетки и играть какую-то биологическую роль.
Образование Z-формы в ЦГ-последовательностях при отрицательной сверхспирализации ДНК можно регистрировать не только методом двумерного гель-электрофореза. Другой метод, широко применявшийся А. Ричем с сотрудниками, состоит в использовании антител к Z-форме. Эти антитела были получены путем иммунизации животных химически модифицированным ЦГ-полимером, который находится в Z-форме при любых условиях. Такие антитела не связываются с ДНК или ЦГ-полимером в В-форме, но сильно связываются с ЦГ-полимером, находящимся в Z-форме. Было показано, что искусственные плазмиды, несущие ЦГ-вставки, начинают связывать антитела к Z-форме, когда их отрицательная сверхспирализация становится достаточно высокой.
Анализ пространственной структуры Z-ДНК привел к заключению, что для этой формы ДНК важно регулярное чередование пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов в каждой из комплементарных цепей. Если такого чередования нет, то Z-форма становится сильно невыгодной по сравнению с В-формой. Поэтому можно было ожидать, что наряду с последовательностями …ЦГЦГЦГ… отрицательная сверхспирализация будет способствовать образованию Z-формы еще в двух простых пурин-пиримидиновых последовательностях:
и
Выяснение этого вопроса было особенно важно потому, что протяженные участки с такими последовательностями сравнительно часто встречаются в эукариотических ДНК. Были сконструированы специальные плазмиды, несущие такие вставки, и проведены опыты по двумерному гель-электрофорезу, связыванию антител к Z-форме, расщеплению однонитевой эндонуклеазой. Эти опыты показали, что, как и ожидалось, ГТ-вставки переходят в отрицательно сверхспирализованной ДНК в Z-форму (образование крестов в таких последовательностях, очевидно, невозможно), а вот АТ-вставки образуют кресты.
Открытие Z-формы буквально всколыхнуло души молекулярных биологов. Вместе с доказательством существования крестов в сверхспиральных ДНК это открытие показало, что, хотя в целом ДНК, безусловно, находится в В-форме, отдельные ее участки могут иметь резко отличающуюся структуру. Начался поиск этих и других структур в ДНК и выяснение их возможной биологической роли.
В ходе работы по выяснению возможной биологической роли альтернативных (отличных от В-формы) структур наиболее популярным оказался ферментативный метод, так как он прост и позволяет локализовать на ДНК место атаки однонитевой эндонуклеазы. Дэвид Лилли (Университет Данди, Великобритания) показал, что кресты атакуются в центре перевертыша, а Роберт Уэллс (Алабамский университет, США) обнаружил, кроме того, что при образовании Z-формы атакуются границы между ней и В-формой.
Генные инженеры, встраивая все новые и новые участки ДНК из самых разных организмов в плазмиды, стали проверять их на чувствительность к однонитевой эндонуклеазе в надежде обнаружить кресты или Z-форму. Действительно, некоторые участки ДНК из высших оказывались очень чувствительными к ферменту. Они получили название гиперчувствительных мест. Когда удалось локализовать эти места, выяснилось, что они всегда находятся в важных регуляторных участках генома. Это привлекло к ним еще большее внимание. Когда же были определены их последовательности, то, к большому смущению исследователей, оказалось, что они – не перевертыши и не чередующиеся пурин-пиримидиновые участки. Как правило, гиперчувствительными к однонитевой эндонуклеазе оказывались последовательности, которые в одной цепи содержат только пурины, а в другой – только пиримидины, т. е. гомопурин-гомопиримидиновые последовательности типа (Г)n•(Ц)n или (ГА)n•(ТЦ)n.
Как же это следовало понимать? Может быть, однонитевая эндонуклеаза предпочтительно атакует такие последовательности, даже если они находятся в нормальной В-форме? Или эти последовательности способны принимать в сверхспиральной ДНК какую-то новую, до сих пор не обнаруженную форму ДНК?
Последняя возможность была особенно интересной, поскольку это означало бы, что мы еще не знаем о структуре ДНК что-то очень важное, причем это «что-то» могло оказаться существенным для функционирования ДНК в клетках эукариот. Специалисты по структуре ДНК взялись за работу, пытаясь выяснить образуют ли гомопурин-гомопиримидиновые последовательности альтернативную структуру, а если образуют, то какую именно.
Возможно, рассуждали одни, эти последовательности могут образовывать левую спираль, не Z-форму, а какую-то другую левоспиральную форму, одну из тех, что можно построить с помощью молекулярных моделей. Нет, возражали другие, все дело в том, что это очень однородные последовательности и поэтому две комплементарные нити могут проскальзывать друг относительно друга, образуя две однонитевых петли по краям гомопурин-гомопиримидинового участка. Однонитевая эндонуклеаза атакует эти петли, что и делает такие последовательности гиперчувствительными. А может быть, указывали третьи, такие последовательности образуют четверные спирали, еще одну гипотетическую структуру, предложенную теоретиками на основе «игры» с молекулярными моделями. Однонитевая эндонуклеаза атакует вершину такой структуры, где должны быть однонитевые петли.
Очень скоро стало ясно, что сам по себе факт гиперчувствительности к однонитевой эндонуклеазе мало что дает, тем более что оставался открытым вопрос об избирательном действии самого фермента. В начале 1985 года В. Лямичев, С. Миркин и автор этих строк (мы тогда работали в Москве, в Институте молекулярной генетики[3]) решили применить к исследованию этого запутанного вопроса метод двумерного гель-электрофореза.
Ознакомительная версия.
