Ознакомительная версия.
Читатель вправе возразить, что приведенные рассуждения справедливы только для уже достаточно сложных организмов типа животных, в то время как совсем примитивные организмы, такие как бактерии, вирусы и плазмиды, компенсируют отсутствие изощренности своей способностью размножаться со страшной скоростью. Это возражение отчасти верно, но только до тех пор, пока такое размножение не причиняет вред людям. Самое изощренное существо на Земле разработало и продолжает разрабатывать мощные средства для истребления вредных микробов. Этот постоянно растущий арсенал средств включает вакцины, антибиотики и различные лекарственные препараты. В предыдущем разделе мы обсудили нашу недавнюю убедительную победу над наиболее коварным врагом, с которым людям пришлось столкнуться, – с ВИЧ.
Хотя на сегодняшний день человеческое тело представляется наилучшей упаковкой, обеспечивающей размножение ДНК, мы все еще являемся свидетелями впечатляющего разнообразия упаковок для ДНК. Двухцепочечная природа ДНК наиболее подходит для быстрого размножения. В самом деле, если мы разведем две ДНКовые цепи и синтезируем комплементарные цепи на каждой из них, то получим две «дочерние» молекулы, идентичные исходной, «материнской» молекуле. Если мы повторим тот же трюк с двумя «дочерними» молекулами, то получим четыре молекулы-«внучки», идентичные их «бабушке». Очевидно, что в n-м поколении мы будем иметь 2n молекул, каждая из которых будет идентична исходной молекуле. Процесс такого рода, ведущий к экспоненциальному росту числа особей, называется цепной реакцией.
Это название пошло от важного класса химических реакций, открытого и объясненного теоретически в 1930-х годах Н. Н. Семеновым и его учениками Ю. Б. Харитоном, Я. Б. Зельдовичем и Д. А. Франк-Каменецким (отцом автора этих строк). Хотя экспоненциальный рост был к тому времени хорошо изучен в биологии, цепные химические реакции были новостью. За их открытие Семенов был удостоен в 1956 году Нобелевской премии по химии. Цепная реакция объяснила явление теплового взрыва, происходящего при использовании обычных взрывных зарядов. Она оказалась столь же важной для проектирования ядерных реакторов и атомной бомбы. Именно из-за шума вокруг атомной бомбы термин «цепная реакция» вошел в обиход и теперь, к месту или не к месту, используется повседневно.
Рис. 44. Три цикла полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Итак, феномен жизни можно рассматривать как ДНКовую цепную реакцию. Эта цепная реакция протекает в контролируемом режиме (подобно цепной реакции в ядерном реакторе), при котором рождаемость примерно уравновешивается смертностью и количество особей остается более или менее постоянным. Но иногда ДНКовая цепная реакция напоминает взрыв: это происходит при эпидемиях заразных болезней.
Сразу же после открытия химических цепных реакций стала ясна аналогия между ними и размножением живых существ. Цепной характер размножения ДНК был очевиден сразу после открытия двойной спирали. Поразительно, что вплоть до середины 1980-х годов никто не пытался осуществить ДНКовую цепную реакцию в пробирке, хотя все для этого уже было. Плавление ДНК (т. е. разделение комплементарных цепей при нагревании) было к тому времени детально изучено. Синтез ДНКовых праймеров уже стал рутинным делом. Удлиняющая праймеры ДНК-полимераза I была общедоступна и широко использовалась (см. главу 5). Молекулярным биологам просто не приходило в голову, с какой стати они стали бы размножать ДНК в пробирке. В одной из своих статей Корана упомянул, что ДНКовая цепная реакция может быть осуществлена путем периодического нагревания и охлаждения образца ДНК в присутствии праймеров и четырех дНТФ при помощи ДНК-полимеразы I. Ну и что? Корана не собирался тратить время, чтобы доказывать кому-то, что такая цепная реакция действительно возможна. Разумеется, возможна! Какие могут быть сомнения?
Скорее всего, Кари Мулис не читал статью Кораны. Мулис работал в одной из биотехнологических компаний, которые стали расти как грибы после дождя в конце 1970-х и в начале 1980-х годов. Работая в биотехе, а не в научном институте, Мулис ясно осознавал, что возможность размножать ДНК в пробирке может привести к подлинной революции в биотехнологии. Он был настолько захвачен идеей о ПЦР, что ему удалось заразить своим энтузиазмом коллег по компании и убедить их поставить опыты. Схема их первых опытов показана на рис. 44.
Прежде всего выбиралась ДНКовая мишень для размножения. Необходимо было знать последовательность оснований в выбранной мишени, по крайней мере концевые последовательности. Затем синтезировали два праймера. Один из них был комплементарен нижней цепи ДНК на левом конце мишени; второй был комплементарен верхней цепи ДНК на правом конце мишени. Оба праймера примешали к образцу в большом избытке по отношению к ДНК-мишени. (ПЦР может быть осуществлена, даже когда в образце исходно находится одна молекула ДНК-мишени.) Также в образце находились в достаточном количестве все четыре дНТФ. После этого образец нагревался до температуры, гарантировавшей плавление ДНК-мишени (т. е. разделение комплементарных цепей). Затем образец вновь охлаждали. В ходе охлаждения синтетические праймеры связывались с комплементарными участками на разделенных цепях мишени, в то время как взаимно комплементарные цепи исходной ДНК-мишени не могли найти друг друга, так как они присутствовали в образце в ничтожно низкой концентрации.
Итак, в результате охлаждения получились два субстрата для реакции удлинения праймера (см. главы 5 и 7). Следовательно, добавление к образцу ДНК-полимеразы I приводило к удлинению двух праймеров навстречу друг другу. Так появлялись две дочерние молекулы. Они частично состояли из двух цепей, но содержали длинные одноцепочечные хвосты. Существенно, что последовательность-мишень была полностью двухцепочечной. Последующие циклы нагревания / охлаждения / добавления полимеразы приводили к синтезу все новых молекул, и у всех них участок-мишень был двухцепочечным.
Как видно из рис. 44, молекулы, состоящие исключительно из последовательности-мишени, появляются только в третьем цикле. В ходе дальнейших циклов их количество растет экспоненциально. Восемь таких молекул образуется на 4-м цикле, 32 738 – на 15-м и миллиард на 30-м. В ходе своих первых опытов Мулис и его коллеги не могли делать так много циклов. Основная проблема состояла в инактивации фермента при нагревании, так что порции свежего фермента приходилось добавлять вновь и вновь в каждом цикле.
Важнейшее усовершенствование, сделавшее ПЦР столь потрясающим методом, состояло в замене ДНК-полимеразы I так называемой Taq-полимеразой. Выделенная и термофильных бактерий, живущих в горячих источниках, Taq-полимераза легко выдерживает нагревание до 94 °C. При такой температуре цепи ДНК расходятся. Taq-полимераза лучше работает в горячих условиях, так что с ее помощью реакцию удлинения праймера ведут при 72 °C.
Использование Taq-полимеразы позволяет проводить ПЦР в полностью автоматизированном режиме, используя простой робот, называемый термоциклером или ПЦР-машиной. В обычной пробирке смешивают ДНК-мишень, четыре дНТФ и Taq-полимеразу в соответствующем буфере, содержащем необходимые ионы металлов. Затем пробирку помещают в термоциклер, который программируется на изменение температуры по следующей схеме: нагрев до 94 °C и выдерживание при этой температуре 1 минуту; охлаждение до 60 °C и выдерживание при этой температуре 1 минуту (на этом этапе праймеры связываются с комплементарными участками на концах мишени); нагрев до 72 °C и выдерживание при этой температуре 1 минуту для проведения реакции удлинения праймера при оптимальной температуре для Taq-полимеразы. Затем термоциклер начинает новый цикл по той же схеме (подъем температуры до 94 °C и т. д.). Затем еще цикл и еще цикл, сколько пожелает оператор.
Одна из многих замечательных особенностей ПЦР состоит в том, что вам не нужно очищать мишень от примеси чужеродной ДНК. Праймеры строго отберут только истинную мишень для размножения, даже если она представлена всего в одном-единственном экземпляре на фоне громадного избытка других молекул ДНК. Отметим также, что в отличие от живой природы, где размножение линейных молекул ДНК сопряжено с серьезным проблемами (см. главу 7), в случае ПЦР проблемы концов не возникает из-за того, что используются синтетические ДНКовые праймеры, а не РНКовые праймеры, как при репликации ДНК в клетке. Выбирая число циклов ПЦР, вы можете получить столько копий молекулы-мишени, сколько пожелаете (точнее, пока не исчерпаете дНТФ или праймеры).
За изобретение ПЦР Кари Мулис в 1993 году получил Нобелевскую премию по химии. Изобретение ПЦР повсеместно признано одним из самых главных прорывов в истории ДНКовых технологий, которая (эта история), как мы знаем, богата замечательными открытиями.
Ознакомительная версия.
