На существо этой сложной проблемы пролили новый свет опыты, проведенные на неживом материале. Если подействовать инфракрасными лучами на некоторые возбужденные фосфоресцирующие вещества, длительность фосфоресценции сокращается, высвечивание происходит быстрее. Вспомним, что фосфоресценция представляет собой послесвечение возбужденных молекул, находящихся в метастабильном состоянии. Фотоны инфракрасного света, поглощаясь этими молекулами, доставляют им недостающую энергию для подъема возбужденного электрона на обычный уровень возбуждения, с которого возврат в исходное состояние, разрядка возбуждения, совершается с максимальной скоростью. В этом примере инфракрасные лучи ослабили действие света (ультрафиолетового или видимого), возбудившего фосфоресценцию, уменьшили длительность послесвечения. Степень фотохимического действия ультрафиолетового света зависит от времени жизни возбужденных состояний облученных молекул. Если с помощью более длинноволнового света «разрядка» совершается быстрее, то фотохимический эффект первого облучения оказывается ослабленным. Так можно объяснить механизм эффекта обращения, обнаруженного на фотоматериалах.
Однако подлинный механизм фотореактивации клеток сложнее. Реактивируются главным образом поражения ядерного наследственного аппарата клеток. В повреждении этого аппарата ультрафиолетовыми лучами имеет значение образование димеров тимина и, в меньшей степени, других пиримидиновых оснований. В процессе фотореактивации эти дефекты, очевидно, каким-то образом устраняются за счет использования лучистой энергии. Но как? Сейчас известно, что димеры — действительно основная мишень фотореактивации. А механизмов ее существует столько же, сколько и видов,— два.
В случае коротковолновой фотореактивации большие кванты излучения, поглощенные азотистыми основаниями нуклеиновых кислот, непосредственно разрывают связи между тиминовыми остатками, освобождают их, облегчая восстановление исходной структуры. Чтобы такой механизм стал возможным, нужна энергия даже несколько большая, чем та, которая привела к образованию димеров. Вот почему для реализации этого механизма нужны лучи с меньшей длиной волны и с большей энергией квантов, чем у лучей повреждающих.
Но в естественных условиях существования жизни на Земле лучи с такой длиной волны и энергией квантов отсутствуют. Поэтому природный механизм фотореактивации сформировался с учетом использования имеющейся лучистой энергии — видимого и длинноволнового ультрафиолетового света. А чтобы этот механизм был достаточно эффективным, природа создала специальный фотореактивирующий фермент.
При знакомстве с явлением живого свечения — биолюминесценции — выяснилось, что высокий коэффициент ее полезного действия обязан участию специализированного фермента люциферазы. Когда же хемилюминесценция тканей совершается без участия фермента, ее эффективность, квантовый выход, снижается в миллионы раз.
Фотореактивация — ферментативный процесс, и благодаря этому димеры тимина, возникшие при ультрафиолетовом поражении живых клеток, устраняются почти полностью. Для того чтобы процесс восстановления достиг максимального выражения, наряду с избытком реактивирующего света необходимо еще и время. Дело в том, что процесс внутриклеточного восстановления совершается в период между клеточными делениями, во время так называемой интерфазы. Наступление митоза (клеточного деления) прерывает процесс восстановления, и не ликвидированные еще повреждения становятся необратимыми. Поэтому всякого рода задержки деления (вызванные, например, понижением температуры, недостаточным питанием и т. п.) облегчают деятельность фермента фотореактивации, делают ее более продуктивной.
Если облучить культуру бактерий или колонию инфузорий бактерицидным ультрафиолетом в дозе, вызывающей гибель практически всех клеток, то после выставления облученной колонии на рассеянный дневной свет выживает от 35 до 70, а иногда и до 90% пострадавших клеток. Такова мощь этого чудо-фермента! Детали его работы еще не вполне изучены. Сравнительно недавно американскому биохимику К. С. Руперту удалось выделить его из дрожжей. Он получен в чистом виде, но его структура и, в частности, устройство хромофора, улавливающего видимый свет, пока не установлены; известно, что максимум поглощения им света лежит у 2800 А. Вероятнее всего, фермент представляет собой флавопротеид. Восстановление поврежденной ультрафиолетом нуклеиновой кислоты совершается в два этапа. Сначала фермент, двигающийся вдоль двойной цепи ДНК, обнаруживает дефект — димер тимина и присоединяется к нему своим активным центром. Энергия видимого света, поглощенная хромофорной группой, используется для того, чтобы отделить фермент от отремонтированного участка ДНК, после чего можно заняться следующим димером. Производство фотореактивирующего фермента «запрограммировано» в генетическом аппарате клетки, где имеется специальный ген, обозначаемый латинскими буквами UVR. Потеря или отсутствие этого гена означает утрату способности к фотореактивации.
Почему же чудо-фермент не справляется со своей благородной задачей на 100%? Для этого есть несколько причин. Прежде всего ультрафиолетовые лучи вызывают появление не только димеров, но и других, не фотореактивируемых типов повреждений (окисление и разрушение отдельных оснований, разрывы цепи и т. п.). Во-вторых, для ремонта части димеров может не хватить времени — наступление митоза прерывает работу фермента.
Значит, полного восстановления и не может быть? Нет, такой вывод был бы преждевременным. Дело в том, что фотореактивация — не единственный механизм ремонта поврежденной ДНК. Эти повреждения могут возникать не только при воздействии ультрафиолетовых лучей. Ионизирующая радиация и различные химические вещества — мутагены способны вызвать разнообразные поломки, изменения, нарушения структуры ДНК. Димеры тимина — лишь один из возможных видов повреждений. Поскольку для ультрафиолета их образование имеет главное значение, постольку фотореактивация — специализированный механизм восстановления — направлена именно против димеров.
Но наряду с этим тонким механизмом в тканях животных (в том числе и лишенных фермента фотореактивации) существует более общий, всеобъемлющий механизм восстановления, Поскольку он не нуждается в свете для своей работы, его называют механизмом темновой репарации. В связи с необходимостью устранять разнообразные дефекты структуры ДНК этот механизм несравненно более сложен: он складывается из содружественной взаимосвязанной работы нескольких ферментов. В процессе темновой репарации димеры (и другие нарушения структуры ДНК) не расщепляются, а удаляются из ДНК. Процесс этот совершается в несколько этапов.
Сначала специальный фермент — он носит название эндонуклеазы — отыскивает поврежденный участок в одной из нитей ДНК и надрезает нить. Следующий фермент — вырезающая нуклеаза или экзонуклеаза — удаляет из молекулы ДНК не только поврежденное звено, например димер тимина. Как заправский хирург, фермент удаляет повреждение «с запасом», оперирует «в пределах здоровых тканей». В итоге его деятельности образуется дефект структуры ДНК, брешь в одной из нитей, достигающая более или менее значительных размеров.
Молекула ДНК не распадается в результате операции выщепления, потому что вторая, неповрежденная нить скрепляет ее. Но роль второй нити этим не ограничивается. Когда встает задача ремонта повреждения, заделки бреши, требуется не только строительный материал. Ведь ДНК — молекула особая: последовательность азотистых оснований в каждой нити ДНК имеет информационное значение, содержит в зашифрованном виде сведения о структуре того или иного клеточного белка. Восстановление будет полным лишь в том случае, если восстанавливается исходная последовательность мономеров ДНК. И вот тут-то неоценимую роль играет вторая, неповрежденная нить ДНК.
Две нити ДНК связаны водородными связями между азотистыми основаниями, причем каждое из оснований имеет только одного напарника. Существует всего две разновидности связей: аденин — тимин (А—Т) и гуанин — цитозин (Г—Ц). Если в одной из нитей все азотистые основания сохранились, при восстановлении дефекта каждое из этих оснований как бы «подбирает» себе пару из имеющихся деталей. Поэтому в ремонтируемом участке нити ДНК порядок азотистых оснований восстанавливается в своем исходном, первозданном виде. Процесс застройки бреши требует участия специального фермента. Ни наличие «стройматериалов» — деталей структуры ДНК, ни присутствие второй неповрежденной сети еще не гарантирует выполнения ремонтных работ. Активная роль принадлежит ферменту ДНК — полимеразе. Завершает процесс темнового восстановления четвертый фермент — лигаза, сшивающий отремонтированный участок ДНК с концами нити, уцелевшими после операции выщепления. В итоге сложного процесса повреждение нити ДНК устраняется, а структура нити восстанавливается полностью.
