Сперматозоиды быков после обработки глицерином хранились при температуре –79 C° (температура твердой углекислоты или «сухого льда») в течение 7 лет и при нагревании показали высокий уровень выживаемости. Но интересно отметить, что даже при такой температуре происходит небольшое ухудшение; более низкая температура улучшает результаты. (110) Также отмечалось, вопреки опыту с уксусными угрицами, что слишком быстрая заморозка может быть вредна. (110)
Человеческие сперматозоиды без использования защитных агентов переносят сверхнизкие температуры по-разному, в зависимости от донора и клеток. В одном исследовании до 10 процентов сперматозоидов пережило пятиминутное охлаждение; результаты варьировались от донора к донору, но для одного донора выживаемость клеток была одинаковой для температуры –79 C°, –196 C° и –269 C°. (110)
Драматическое свидетельство жизнеспособности замороженной человеческой спермы было представлено в статье New York Times (Detroit Free Press) от 6 сентября 1963 года. Два ребенка были рождены женщиной, оплодотворенной спермой, хранившейся в течение двух месяцев при температуре жидкого азота. По другим сообщениям, доктору Джерому К. Шерману из Арканзасского Университета удалось хранить сперму при этой температуре в течение трех с половиной лет без потерь жизнестойкости.[18]
Доктор С. У. Якоб с коллегами сообщили об охлаждении клеток коньюктивы[19] и спермы до менее чем 1 K° с сохранением жизнеспособности. (50)
Сердце куриного эмбриона после обработки раствором глицерина было охлаждено до –19 °C°, и биение сердца возобновилось после нагревания. Этот эксперимент побудил доктора Д. К. С. МакДональда из Университета Оттавы, эксперта в области низкотемпературной физики, написать: «… возможно, наступит день, когда вы, при желании, сможете „пребывать в спячке“ тысячу лет или около того в жидком воздухе, а потом быть „разбуженными“ снова, чтобы увидеть, как мир изменился за это время». (65)
В случае с млекопитающими, попытки заморозки, хранения, нагрева и оживления не были полностью успешными. Однако удалось добиться множества частичных успехов и многое узнать.
Наиболее известны эксперименты доктора Одри У. Смита из Национального Института Медицинских Исследований, Милл Хилл, Лондон, работавшего с золотистыми хомячками. Эти животные были успешно оживлены, будучи наполовину заморожены. В частности, более половины воды в мозгу превратилось в лед, и тела затвердели; тем не менее, эти млекопитающие пришли в себя и вернулись к нормальному функционированию. (110) Это очень важно, поскольку в некоторой степени показывает, что интеллектуальные способности могут переживать заморозку и оттаивание.
Следует отметить, что результаты доктора Смита были достигнуты грубыми средствами: заморозка осуществлялась с помощью холодных ванн и пузырей со льдом, и при оживлении использовались только искусственное дыхание и микроволновая диатермия. Ткани не были ничем защищены, хотя уже было известно, что эффект от защитных агентов может быть значительным.
Похожие результаты были достигнуты Андьюсом и Лавлоком, которые сообщили о выздоровлении и выживании в течение длительного времени от 80 до 100 процентов замороженных крыс. (110) Доктор Дж. Р. Кеньон и его коллеги охлаждали собак до температуры, близкой к точке замерзания, с прекращением сердцебиения и кровообращения и достигли достаточно полного восстановления, когда собаки выживали в течение многих недель после эксперимента. Для предотвращения накопления вредных продуктов метаболизма использовались химические вливания. (55)
Механизм повреждений при заморозке все еще недостаточно хорошо изучен. Различные типы клеток, и даже отдельные клетки одного типа, сильно отличаются по выносливости. Различные температурные интервалы также имеют свои особенные проблемы.
Эксперименты, направленные на проверку новых теорий и новых защитных агентов и методов, ведутся активно, но в сравнительно небольших масштабах. К тому времени, когда общество заинтересуется заморозкой, прогресс значительно ускорится. Не во всех случаях можно ускорить научный прогресс, просто увеличив расходы, но в этом отдельных случаях такая возможность существует. Очевидно, что по многим направлениям исследования не ведутся просто из-за недостатка специалистов.
Среди всего прочего, необходима работа по систематическому поиску новых защитных агентов.
Даже учитывая, что работа сейчас ведется с относительно небольшой скоростью, многие ученые настроены оптимистично. Доктор А. С. Паркес, член Королевского Общества, в предисловии к книге доктора Смита пишет, что в следующем десятилетии (1961-71) «Хранение [при глубокой заморозке] целых органов для трансплантации может стать возможным…»[20] (110)
Доктор Хуан Негрин мл. (Госпиталь Ленокс Хилл, Нью-Йорк) говорил в 1961 году: «Мы уже работаем над методами приостановки жизни с помощью заморозки всего тела. Мы уже добились успеха в работе с некоторыми животными». (117) Несомненно, некоторыми успехами мы будем обязаны методу проб и ошибок. Но для того, чтобы лучше понимать будущие перспективы и сегодняшние возможности, нам нужно изучить сегодняшние представления о повреждениях при заморозке.
Механизм повреждений при заморозке
Есть несколько причин, по которым клетки и ткани животных часто не выживают после глубокой заморозки, последующего хранения и нагревания.
Прежде, чем мы перечислим эти возможные причины повреждений при заморозке, следует отметить, что «не выживают» — это очень неопределенное и, возможно, вводящее в заблуждение выражение. Обычный критерий выживания — это возобновление функционирования в случае с органом или рост клеточной культуры или успешная трансплантация или автореплантация (пересадка ткани обратно в животное-донор) в случае с тканью. Ткань, находящаяся лишь немного ниже границы выживания называется «мертвой», а эксперимент, в котором лишь небольшая доля клеток выживает, обычно считается неудавшимся. Но на самом деле, почти удавшиеся и частично удавшиеся эксперименты дают значительные основания для оптимизма, поскольку они указывают на сравнительно небольшой объем повреждений.
Ниже перечислено несколько отдельных видов повреждений при заморозке, хотя не все из них являются взаимоисключающими.
1. Возможны механические повреждения при формировании кристаллов льда.
Наиболее очевидная возможность повреждений связана с колющим, давящим или разрывающим действием формирующихся ледяных кристаллов на клеточные мембраны и целые клетки. Странно, однако, что подобные результаты наблюдаются довольно редко, хотя иногда это и может происходить. (В случае с растительными клетками, с их более жесткими мембранами, подобные повреждения происходят намного легче.)
При медленном охлаждении со скоростью около одного градуса в минуту чистый лед постепенно отделяется от клеточного раствора, и кристаллы льда формируются за мембраной в межклеточном пространстве. Более медленное охлаждение увеличивает размер формирующихся кристаллов и уменьшает их число; более быстрое охлаждение — наоборот. По достижении так называемой эвтектической температуры[21] остаток раствора замерзает и превращается в смесь кристаллов льда и различных солей и гидроксидов.
Существует достаточно доказательств того, что формирование кристаллов льда не всегда смертельно, несмотря на то, что вода при замерзании расширяется. Меримен пишет: «Экспериментальные работы в области обморожений показали, что нога собаки может выдержать охлаждение тканей до температур существенно ниже точки замерзания на время до тридцати минут… Нет никакого сомнения, что ледяные кристаллы формируются, но, несмотря на это, ткань выживает… довольно уверенно можно утверждать, что в мягких тканях, свойственных представителям Царства животных, возможно формирование ледяных кристаллов в межклеточном пространстве и значительное сжатие ими клеток без негативного воздействия на выживаемость последних». (70)
При быстрой заморозке формируются кристаллы льда значительно меньшего размера, и, возможно, именно поэтому, опасность механических повреждений намного меньше, хотя общий объем льда, естественно, не меняется. С другой стороны, при быстрой заморозке вода не успевает покинуть клетку, из-за чего формируются небольшие внутриклеточные или даже внутриядерные кристаллы льда, что создает опасность повреждений. Размер этой опасность сложно оценить, но она может быть значительной — кристаллы льда могут, к примеру, повредить ядро клетки.
2. Возможна опасная концентрация электролитов.
Поскольку заморозка вызывает разделение воды (в виде льда) и растворенных в воде веществ, происходит дегидратация. Жидкость, остающаяся в клетке имеет необычайно высокую концентрацию солей и других веществ с близким строением, называемых «электролитами», которые обладают особыми электрическими и химическими свойствами. Подобные значительные изменения внутри клетки могут быть для нее губительными. (69)
