Лобовой атакой такую инертную молекулу не взять. Не лучше ли для этого сначала запустить «троянского коня»? Так природа и поступает, используя ферменты, основное назначение которых ослабить межатомные связи и подготовить молекулу к реакции. В этом им помогает вода — прекрасный растворитель. Известно же, что в растворах реакции протекают лучше. Сразу стоит сказать, что у ферментов строгое разделение труда: каждый из них отвечает за ускорение той реакции в организме, к которой он приставлен. Целый табун троянских коней нужен для обеспечения жизнедеятельности!
Как всякие эффективные катализаторы, металлофер-менты — это сложные системы, представляющие собой комплексы металлов и белков (помните, нужный катализатор для синтеза аммиака удалось получить лишь подобрав определённую смесь?). Такие ферменты тогда и только тогда обладают активностью, когда в них содержатся и металл и белок. В этом случае металл называют кофактором, а белок — апоферментом. Но прочная химическая связь между ними имеется не всегда. Во многих энзимах металл и белок сближаются лишь во время реакции.
Энергетическое действо в живом развёртывается подчас не на молекулярном и даже не на атомном, а на электронном уровне. И тогда становится понятным, почему в качестве ускорителей выступают именно металлы. У них внешние, валентные электроны удерживаются значительно слабее, и оторвать их гораздо легче, чем у неметаллических элементов. Именно наличием таких неустойчивых электронoв и объясняется лёгкость, с которой в металлах возникает электрический ток. Вспомним хотя бы хрестоматийные опыты великого итальянского физиолога Луиджи Глльвани, когда он получил электрический ток всего лишь прикоснувшись стержнями из разных металлов к препарированной лапке лягушки.
Кошмар, для кинетики
Пока приходится только догадываться, каким образом происходит фиксация атмосферного азота микроорганизмами. Достоверно лишь то, что обмен у азотфиксаторов осуществляется в 10 раз интенсивнее, чем у других бактерии. Ещё бы, им так приходится трудиться, чтобы разорвать тройную связь!
Инертная молекула азота сокрушается благодаря металлоферменту, получившему в 1934 году название «нитрогеназа». Ее фантастические свойства не оставляют равнодушными даже видавших виды специалистов. Вот, например, мнения, почерпнутые нами из двух сугубо научных и узкоспециальных статей.
Один из авторов, американский исследователь Р. Харди просто не в силах сдержать восторга: «В течение многих десятилетий непревзойдённая каталитическая способность этого фермента (нитрогеназы.— Е. Т.) привлекала и очаровывала учёных, работающих в области неорганической химии и биохимии».
Другой — Р. Берне, коллега Харди, настроен более скептически: «Отнесение нитрогеназы к ферментам можно рассматривать как формальное, так как оно не соответствует классическому определению этого понятия, и для нитрогеназы такое отнесение основано лишь на её функциях. Вследствие сложности системы и вероятной уникальности реакционных смесей, используемых в каждой конкретной химической лаборатории, нельзя не отметить, что многие из этих систем, возможно, не имеют отношения к условиям функционирования нитрогеназы in vivo (то есть в живом организме.— Е. Т.). Поэтому не удивительно, что нитрогеназную систему назвали «кошмаром для кинетики».
Берне был явно огорчён той невероятной сложностью, с которой давался каждый шаг познания тайн живой азотфиксации.
Мысль о том, что фиксация азота происходит благодаря ферментам, была впервые высказана замечательным советским биохимиком Алексеем Николаевичем Бахом. Но здесь не обошлось без курьёзов. Ещё в 1934 году Бах вместе со своими сотрудниками опубликовал небольшую статью об успешном получении бактериальных экстрактов, способных фиксировать азот. Однако другим учёным не удалось воспроизвести предложенную методику экспериментов. В то время ещё не были известны все те жесточайшие требования к чистоте этих опытов, благодаря которым только и был достижим успех. Это обстоятельство надолго отбило охоту исследовать столь коварный процесс. Главным, пожалуй, было то, что ещё не наступила эра эффективных аналитических методов исследования с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР), ядерного квадрупольного резонанса (ЯКР), электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), эффекта Мессбауэра, хроматографии...
Чрезвычайно сложные исследования, все же продолжавшиеся в течение последующих лет усилиями отважных одиночек, завершились успехом лишь в 1960 году. Именно тогда группа американских учёных во главе с Дж. Карнаханом представила бесспорные доказательства получения активных экстрактов из культур бактерий-азотфиксаторов. По их методу уже можно было воспроизводить препараты, фиксирующие молекулу азота. Это была нитрогеназа. Как удалось установить, нитрогеназа — сложный фермент, состоящий из двух белковых комплексов. Первый из них с молекулярной массой 200 тыс. содержит в качестве активаторов молибден, железо и серу. Второй, молекулярная масса которого гораздо меньше и составляет 50 тыс., имеет в своём составе только железо и серу. Можно считать, что в целом молекула нитрогеназы содержит 32 атома железа и 2 атома молибдена.
Как всякие белки, ферменты состоят из очень больших молекул, которые ещё называют макромолекулами. Одной из главных характеристик таких огромных молекул служит масса. Если судить по этому показателю, то нитрогеназа явно чемпион в тяжёлом весе среди ферментов.
Итак, когда про нитрогеназу сегодня многое стало известно, можно ли утверждать, что кончился этот «кошмар для кинетики»? Вряд ли. По-прежнему непросто экспериментировать с капризным ферментом. Прежде всего, исключительно трудно определить соответствие нитроnii.iae препаратов, с которыми работают разные исследо-n;iте-ли. Даже незначительные потери при очистке каждого in се белков могут привести к необратимым изменениям свойств всей системы. Трудность хранения белков усугубляется ещё и тем, что они чрезвычайно быстро окисляются па воздухе.
А если её смоделировать
Целые научные институты, различные лаборатории и исследовательские коллективы были поглощены изучением нитрогеназы, неизбежно распыляясь при этом и где-то повторяя друг друга. Естественно, это не шло на пользу делу. Для того чтобы объединить усилия биохимиков, химиков и физиков, а также для координации их работы в нашей стране в 1976 году Межведомственный совет по молекулярной биологии и молекулярной генетике Академии наук СССР утвердил проект под названием «Нитрогеназа и её модели». В его осуществлении участвуют Институт химической физики, Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова, Институт биохимии им. А. Н. Баха и некоторые другие учреждения Академии наук СССР. Руководителем проекта был назначен доктор химических наук, профессор А. Е. Шилов.
Цель проекта не ограничивается созданием катализаторов для фиксации азота в мягких условиях. Она включает разработку эффективных синтезов других вещёств, например гидразина. Это соединение из двух атомов азота и четырёх атомов водорода представляет собой высококалорийное топливо, при сгорании которого получаются только азот и вода. Таким образом, загрязнения окружающей среды не происходит. Конечно, было бы весьма заманчиво использовать в автомобиле вместо бензина гидразин, но он пока ещё очень дорог.
Несколько лет назад А. Е. Шилов и Г. И. Лихтенштейн предложили сравнительно простую схему действия нитрогеназы. Молекула азота проникает внутрь фермента через щель, соответствующую её размерам, и там активируется электронами восстановителя, которые, словно эстафеты, передаются по цепям молибдено- и железосодержащих центров. Активацию усиливают также и группировки серы. В качестве восстановителя выступает водород, который, в свою очередь, активируется другими ферментами.
Дальнейшие исследования экстракций из различных бактерий привели к открытиям и других железосодержащих ферментов. В начале 60-х годов был выделен фер-редоксин с молекулярной массой 6 тыс. В нем помимо железа роль активных центров играет и сера. Как видим, во всех катализаторах сохраняется принцип множественности компонентов. Интереснейшим свойством ферре-доксина оказалось то, что он имеет наиболее отрицательный потенциал среди природных переносчиков электронов. В 1965 году были открыты ещё два белка, содержащих железо и выполняющих функции переносчиков электронов. Это так называемый парамагнитный белок с молекулярной массой 24 тыс. и рубредоксин, масса которого составляет 6 тыс. В последнее время стали известны и другие железо содержащие белки, функции которых ещё до конца не выяснены.
