служащие в качестве датчиков или проводников. Метеорологический зонд запускают в атмосферу для сбора данных, помогающих делать прогноз погоды. Врачи пользуются зондами – тонкими стержнями или полыми трубочками – для проведения диагностических или лечебных процедур в различных полостях и каналах тела пациента.
В генной инженерии зондирующий ген служит для распознавания фрагментов молекул ДНК. Вся генная инженерия со всеми ее разветвлениями и узкими специализациями основана на принципе комплементарности, на нерушимых правилах «взаимного влечения» азотистых оснований.
Клонированные гены-зонды обрабатывают радиоактивными атомами или флуоресцентным (светящимся) химическим веществом, чтобы они были хорошо видны, а затем разделяют обработанные зонды на одинарные цепочки и смешивают их с растворами различных нуклеиновых кислот, также предварительно разделенных на одинарные цепочки. Хорошо видимые «светящиеся» зонды связываются с комплементарными фрагментами нуклеиновых кислот – вот он, нужный вам фрагмент, я на нем сижу!
Дальше – просто. Нужный участок вырезается при помощи рестриктаз, или отмечается на генетической карте, или же просто учитывается – гены-зонды нередко используют для оценки количества матричной РНК, полученной в результате транскрипции конкретного гена. Количество матричной РНК – показатель экспрессии гена.
Серьезной проблемой стала проблема внедрения нужного гена или же нужной молекулы ДНК (а иногда и РНК) в клетку. Те, кто любит читать шпионские романы и смотрит фильмы о шпионах, хорошо знают о том, насколько серьезна и важна эта проблема. Шпион или разведчик, если речь идет о нашем человеке, должен внедриться куда следует так, чтобы его приняли за своего. То же самое происходит и с пересаживаемыми генами. Они должны проникнуть в клетку, используя естественные возможности проникновения или хотя бы такие, которые не нарушают жизнедеятельности клетки, потому что в мертвой клетке от пересаженных генов никакой пользы не будет. Их же не развлечения ради пересаживают, а для того, чтобы получить нужный результат. А как получается результат? В результате (простите за такой каламбур) размножения клеток с измененным генотипом.
Внедряемый ген может быть как «диверсантом», которому нужно функционировать в течение определенного срока, так и «резидентом», засылаемым в клетку навсегда. Экспрессия гена в течение определенного срока часто используется в лечебных целях. Излечили заболевание – и точка, ген больше не нужен.
Кстати говоря, гены можно вводить в клетку, но не вставлять в клеточные молекулы ДНК. Достаточно снабдить каждый трансген своим промотором – фрагментом, с которого РНК-полимераза будет начинать транскрипцию матричной РНК, и можно считать, что дело сделано.
При создании определенных условий, перечислять которые нет необходимости, ДНК может проникать внутрь клетки пассивным образом, то есть без помощи каких-либо «переносчиков». Возможно и такое же пассивное «встраивание» гена-чужака в молекулу ДНК.
Транспорт генов в клетку может осуществляться при помощи электрической стимуляции клеточных мембран. Воздействие электрического тока (слабого) изменяет проницаемость мембраны. Кроме того, под действием внешнего электрического поля возможно направленное перемещение частиц (вспомните про электрофорез).
У бактерий, помимо одной-единственной «основной» хромосомы (ядер бактерии не имеют), существуют и маленькие, рассеянные по цитоплазме. Такие мини-хромосомы называются плазмидами. Относительно небольшие молекулы ДНК плазмид свернуты в кольцо.
Если прикрепить к плазмиде ген, то плазмида может выступать в роли переносчика (проводника), поскольку бактериальные клетки охотно поглощают чужие плазмиды. Поскольку молекулы плазмидной ДНК невелики, [44] с ними удобно работать. Правда, в качестве переносчика плазмиды могут выступать только при внедрении генов в бактериальные клетки и ни в какие другие.
Существуют устройства, называемые «генными пушками» или «ДНК-пушками». Эти «пушки» обстреливают клетку «снарядами», содержащими нуклеиновые кислоты. «Снаряд» представляет собой фрагменты нуклеиновой кислоты (трансгены), связанные с частицей металла, например золота или серебра [45]. Разница с обычным снарядом состоит в том, что у обычного снаряда «начинка» находится внутри, под оболочкой, а в генном «снаряде» гены облепляют частицу металла снаружи.
Из «генных пушек» обстреливают культуры клеток, находящиеся в чашке Петри – круглой чаше, стандартной микробиологической посуде. Клетки, находящиеся в центре чаши, обычно гибнут вследствие разрушения их мембран и прочих структур частицами металла, но какая-то часть клеток на периферии остается цела.
Обстрел клеток из пушек, да еще и «прямой наводкой», – процедура суровая, и не каждая клетка способна ее выдержать. Преимущественно «генные пушки» используют для обстрела растительных клеток, которые гораздо прочнее клеток животных.
Иногда случается так, что пассивный перенос генов в клетку ни при каких условиях не возможен, электростимуляция мембраны малоэффективна, а стрелять из пушек никак нельзя – погибнут не только центровые, но и все периферические клетки. А гены внедрить надо. Вот как хотите, а надо!
И что делать?
«Кавказскую пленницу», которая «Новые приключения Шурика», все смотрели?
Фразу: «Тот, кто нам мешает, тот нам поможет!» – все помнят?
Вот примерно так же рассуждали и генные инженеры, которые решили приспособить вирусы для переноса генов. Сколько можно нам вредить? Пора бы и пользу приносить!
Вирусы умеют проникать в клетку и заставлять ее синтезировать свои собственные нуклеиновые кислоты, но при этом вирусы не наносят выраженного повреждения клеточной ДНК! Вирусу нужно жить в клетке и пользоваться ее ресурсами, поэтому он ведет себя как вежливый квартирант, хотя и незваный. Но этого незваного квартиранта можно превратить в ценного научного сотрудника, если дать ему задание по внедрению в клетку конкретного гена или группы генов. И чем наглее и напористее квартирант, тем лучшим сотрудником он окажется. Для трансгенеза используются наиболее агрессивные вирусы, способные проникать практически в любые клетки. Разумеется, с вирусами проводят определенную работу – изменяют их так, чтобы они стали безопасными и действовали исключительно в целях науки – доставляли бы в клетки нужные исследователям гены и обеспечивали бы их внедрение в молекулу ДНК.
К сожалению, сознательность у вирусов пока еще хромает, причем сильно. В клетки они внедряются, тут уж без разговоров, но вот дальше ведут себя по-разному. Могут внедрить в молекулу ДНК принесенные гены, а могут и не внедрить. А еще могут внедрить не туда, куда следовало, перепутав участки на молекуле ДНК. И ничего с ними, саботажниками этакими, не поделаешь, «воспитанию» вирусы не поддаются. Безмозглые они, не наделила их природа мозгами и разумом, не могут они действовать по точно заданному плану. Поэтому, «натравив» вирусы на клетки, ученые затем отделяют условные «зерна» от условных «плевел» – отбирают для дальнейшей работы те клетки, в которых вирусы сделали все, как надо. Когда вы слышите о
