Когда впервые стало возможным количественное сравнение аминокислотных последовательностей белков, оно вызвало большой энтузиазм, поскольку этот новый подход казался весьма многообещающим для выяснения эволюционного родства. В 1962 г. Цукеркандль (Zuckerkandl) писал: «Благодаря недавно приобретенным знаниям о зависимостях между белками и генами изучение аминокислотных последовательностей белков может теперь дать наиболее точное и определенное представление об эволюционных взаимоотношениях и о некоторых фундаментальных механизмах эволюции». А в 1969 г. Дейхоф и Экк (Dayhoff, Eck) писали: «Заветная мечта биохимиков состоит в том, чтобы иметь возможность разработать полное, подробное, снабженное количественными параметрами филогенетическое древо - историю происхождения всех видов живых существ до самых ее истоков. Биологи питали эту надежду в течение долгого времени; теперь биохимия имеет реальную возможность выполнить это». Поистине задача, достойная самого Геккеля.
Главное рабочее допущение, принимаемое при построении филогенетического древа на основании данных о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, состоит в том, что в пределах каждого набора гомологичных последовательностей, таких как цитохром с, замены нуклеотидов, а следовательно, и аминокислот происходят с постоянной частотой. Из этой гипотезы постепенности вытекает интересное следствие о том, что скорости замены ведут себя как молекулярные часы, ход которых не зависит от скоростей морфологической эволюции.
В 1963 г. Марголиаш (Margoliash) высказал мысль, что эволюция аминокислотных последовательностей в белках и морфологическая эволюция, возможно, не сопряжены друг с другом. Марголиаш указал, что если истекшее время определяет число замен, накопившихся в данном белке, то эволюция аминокислотной последовательности может служить часами, позволяющими измерить время, прошедшее с момента дивергенции любых двух видов. Он высказал пророческое предположение, что «... полезной проверкой важной роли времени как главного фактора в накоплении изменчивости в цитохроме с должно быть сравнение аминокислотных последовательностей гомологичных белков, выделенных из видов, о которых известно, что они на протяжении длительных периодов времени не претерпевали морфологических изменений, и из быстро изменяющихся видов ...». Использование молекулярных часов для вскрытия зависимости между эволюцией структурных генов и морфологической эволюцией позволило выявить некоторые очень интересные аспекты эволюции генома, ответственные за морфологическое изменение. Дикерсон (Dicherson, 1971) опубликовал превосходное введение в проблему белковых часов, а более новый и исчерпывающий ее разбор дали Вилсон, Карлсон и Уайт (Wilson, Carlson, White, 1977).
Прежде чем обсуждать взаимоотношения между молекулярными часами и морфологической эволюцией, следует установить достоинства и недостатки таких часов.
Данные, лежащие в основе гипотезы об однородной и характерной для каждого данного белка скорости эволюции, представлены на рис. 3-1, где показана зависимость между числом мутационных шагов, оцениваемым по числу различий в аминокислотных последовательностях гомологичных белков, и временем дивергенции организмов, из которых эти белки были выделены. Временем дивергенции считается число лет, прошедших с тех пор, когда у двух данных организмов имелся общий предок, и до настоящего времени. Возьмем, например, цитохром с млекопитающих и рептилий. Палеонтологическая летопись показывает, что звероподобные рептилии дивергировали от других рептилий примерно 300 · 106 лет назад. Цитохромы ныне живущих млекопитающих отличаются от цитохромов ныне живущих рептилий примерно 15 заменами на 100 аминокислот. Следовательно, в этом случае на возникновение 15%-ного различия понадобилось 300 · 106 лет, или 20 · 106 - для различий в 1%. Время, необходимое для 1%-ной дивергенции по любому белку, Дикерсон (Dickerson) назвал единицей эволюционного времени (ЕЭВ). Для цитохрома с, следовательно, ЕЭВ равно 20 · 106 лет. У других белков средние скорости эволюции также постоянны, однако абсолютные скорости эволюции у разных белков различны. В частности, для приведенного на рис. 3-1 гемоглобина ЕЭВ равна 5,8 · 106 лет, а для фибринопептида - всего 1,1 · 106 лет.
Рис. 3-1. Скорости эволюции трех белков: фибринопептидов, гемоглобина и цитохрома с (Dickerson, 1971).
Различия в ЕЭВ отражают, по-видимому, разную степень отбора, которому подвергаются разные белки. Ограничения, налагаемые на скорость замены аминокислот в цитохроме с, вероятно, проистекают из его тесной связи с другими белками, входящими в митохондриальную цепь переноса электронов. Глобины также представляют собой функциональные белки, взаимодействующие как с малыми молекулами, так и с другими субъединицами глобинов. В отличие от них о функции фибринопептидов ничего не известно, за исключением того, что это лишь фрагменты, отрезанные от белка с более длинной цепью - фибриногена - при превращении его в фибрин во время образования кровяного сгустка.
Фитч (Fitch) и Лэнгли (Langley) подвергли проверке гипотезу о молекулярных часах, рассмотрев совокупную скорость для семи различных белков, по которым собраны обширные данные об эволюции их аминокислотных последовательностей. Хотя структурные гены, кодирующие каждый белок, характеризуются собственными частотами допустимых нуклеотидных замен, график зависимости числа замен для этих семи белков от времени, прошедшего после дивергенции организмов, из которых они были выделены, представляет собой прямую линию с наклоном, соответствующим 0,47 · 10 -9 замен на одну пару нуклеотидов в год. Отклонения наблюдались только для белков, выделенных из тканей приматов. Эти отклонения могут быть результатом различий в скоростях эволюции белков у приматов или же, что более вероятно, ошибочных оценок времени дивергенции среди приматов по причине скудности ископаемых остатков по этой группе. Средняя скорость замены нуклеотидов, определенная Фитчем и Лэнгли, относится только к тем заменам, которые привели к изменению в аминокислотной последовательности. На основе изучения данных о нуклеотидной последовательности РНК, участвующей в синтезе гемоглобина (Salser et al., Forget et al.), Фитч и Лэнгли пришли к заключению, что непроявляющиеся мутации, т. е. изменения оснований, не приводящие к замене одной аминокислоты на другую, могут происходить в пять раз чаще, чем изменения, влекущие за собой аминокислотные замены. Так, общая частота замены нуклеотидов в структурных генах может достигать 2,8 · 10 -9 на одну пару нуклеотидов в год. Здесь следует отметить, что лежащее в основе всех этих расчетов допущение о линейности молекулярных часов недавно было подвергнуто сомнению со стороны Корручини и др. (Corruccini et al.), а данные, которыми мы располагаем, недостаточно точны, чтобы можно было решить, является ли дивергенция линейной или нелинейной. В то время как аминокислотные последовательности белков дают возможность оценить очень специфический аспект эволюции генома - те части структурных генов, в которых заключены кодирующие последовательности, - непосредственные исследования ДНК позволяют количественно оценить частоту замены нуклеотидов в кодирующих и некодирующих элементах генома. Очевидно, что самый прямой способ получения таких данных состоит в определении нуклеотидных последовательностей ДНК, подобно тому как определяются аминокислотные последовательности белков. Недавно были разработаны методы, делающие возможным такой подход, и в ближайшее время можно будет получить большое число последовательностей ДНК. Те количественные данные об эволюции ДНК, которыми мы в настоящее время располагаем, получены по большей части в экспериментах по гибридизации ДНК, не требующих непосредственного определения нуклеотидных последовательностей изучаемой ДНК.
Принципы гибридизации просты. Двойная спираль состоит из двух цепей ДНК, соединенных друг с другом при помощи водородных связей между парами комплементарных оснований: аденин всегда образует пару с тимином, а гуанин - с цитозином. В нативной ДНК две ее цепи образуют правильные пары по всей длине. Двухцепочечная ДНК может быть разделена на две одиночные нити. При соответствующих концентрациях солей и температуре комплементарные одиночные цепи могут воссоединяться, вновь образуя двухцепочечную ДНК. Существует несколько методов отделения двухцепочечной ДНК от одноцепочечной, что позволяет легко проследить за процессом ренатурации.
Геномы прокариот организованы таким образом, что каждый ген (или последовательность нуклеотидов в ДНК) обычно представлен в одной копии на гаплоидный геном. У эукариот дело обстоит сложнее. В основном геном состоит из единичных генов, но довольно значительная его часть (например, 25% у дрозофилы и 40% у мыши) состоит из последовательностей, повторяющихся от 102 до 106 раз на гаплоидный геном. Наиболее высокоповторяющисся последовательности (например те, что составляют 10% генома мыши, повторяясь 106 раз) - это последовательности сателлитной ДНК; они состоят из простых тандемных повторов, расположенных в виде дискретных блоков в определенных участках хромосом. Между последовательностями, представленными в геноме одной копией (уникальными), разбросаны умеренно-повторяющиеся последовательности, число копий которых варьирует от нескольких сотен до нескольких тысяч. Эксперименты с гибридизацией могут быть использованы для изучения эволюционных изменений, происходивших как в уникальных, так и в повторяющихся последовательностях. При этом можно получить данные двух типов. Исследуя кинетику гибридизации, можно определить число копий, а тем самым и то, как в процессе эволюции изменялась представленность данной последовательности в ДНК того или иного организма. Кроме того, эксперименты с гибридизацией не ограничены соединением комплементарных цепей ДНК, принадлежащих одному организму. Разделенные цепи ДНК из двух разных организмов можно смешать и дать им возможность соединяться. При достаточной степени родства между организмами это приведет к образованию двухцепочечных ДНК. Степень дивергенции между близкими, но не идентичными цепями таких гибридов можно легко оценить, потому что любое отклонение в последовательности нуклеотидов означает, что гибридные ДНК будут содержать несколько нуклеотидов, которые не образуют пар. Неспаренные основания снижают общую стабильность гибридной молекулы. Снижение стабильности можно измерить по последующему снижению температуры плавления такой ДНК, т. е. температуры, при которой две ее цепи разделяются. Отсутствие соответствия у 1,5% оснований приводит к снижению температуры плавления по сравнению с нативной ДНК на 1°С. Это очень мощный метод: он позволяет определить степень дивергенции нуклеотидов в ДНК любых двух организмов независимо от определения аминокислотных последовательностей белка или прямого определения последовательности ДНК.
