Рис. 4-7. Нормальные зародыши и зародыши с двойным брюшком двукрылого Smittia. У нормального зародыша (А) видна слева развивающаяся голова, а справа-брюшные сегменты. У зародыша Б, которого облучали ультрафиолетом, голова отсутствует и на обоих концах тела развиваются брюшные сегменты (Kalthoff, 1969).
Вторая группа данных, указывающих на детерминирующую роль РНК в развитии переднего конца тела зародыша, получена в результате непосредственного воздействия специфических ферментов на цитоплазму переднего конца зародыша. Кандлер-Зингер (Kandler-Singer) и Калтхоф погружали зародыши в среду, содержащую исследуемый фермент, и затем прокалывали их в определенных местах. Образование дуплицированного брюшка происходило лишь в тех случаях, когда в передний конец яйца проникала активная РНКаза. Если использовалась неактивная РНКаза или если она проникала не в передний конец яйца, а в другие его участки, то дуплицированное брюшко получалось лишь в очень немногих случаях.
Есть и другие более косвенные данные о том, что РНК играет роль детерминанта и у других организмов. Образование зародышевых клеток на заднем конце яиц насекомых (и многих других организмов) зависит от детерминантов, называемых полярными гранулами, которые легко наблюдать в микроскоп. В ряде интересных экспериментов Илмензе и Маховалд (Ilmensee, Mahowald) вводили цитоплазму из заднего конца яйца дрозофилы одной генетически меченной линии в передний конец яйца другой генетически меченной линии. При этом на переднем конце яйца формировались зародышевые клетки. Полярные гранулы, подобно детерминантам переднего конца тела, чувствительны к облучению ультрафиолетом и, судя по реакции на цитологические красигели, содержат большое количество РНК. Домен и Вердонк (Dohmen, Verdonk) обнаружили в полярных лопастях зародышей некоторых брюхоногих моллюсков структуры, аналогичные полярным гранулам. Эти структуры, которые, как было установлено при помощи специфичных красителей, богаты РНК, по-видимому, содержат детерминанты, специфичные для полярных лопастей. Было бы заманчиво попытаться установить связь между этими структурами и очевидным обособлением мРНК в полярных лопастях, которое наблюдали Ньюрок и Рэфф, но достаточных оснований для этого у нас нет.
Возможно, из-за того что в настоящее время все внимание молекулярной биологии сосредоточено на нуклеиновых кислотах, экспериментальным изучением белков как локализованных детерминантов ядерной активности занимаются мало. А между тем такие белковые молекулы почти несомненно существуют. Так, у аксолотля имеется мутация, при которой отсутствие одного определенного белка оказывает резко выраженное воздействие на развитие. Эта мутация, обозначаемая буквой о (oocyte deficient), приводит к тому, что яйца, отложенные самками, гомозиготными по мутантному аллелю о, прекращают дробление и гибнут примерно в то время, когда нормальные зародыши проходят гаструляцию. Мутация о - классическая мутация с материнским эффектом, т. е. развитие потомков зависит только от генотипа матери (см. гл. 7). Таким образом яйца, отложенные самкой, гомозиготной по аллелю о (о/о), не развиваются даже при оплодотворении нормальной спермой. В отличие от этого все яйца гетерозиготной самки (о/ + ), даже та их половина, которая несет аллель о, развиваются нормально. Поскольку генотип самца не играет роли, самок, имеющих генотип о/о, можно получить, оплодотворяя яйца гетерозиготных самок спермой самцов, несущих аллель о. Бриггс и Кассенс (Briggs, Cassens) обнаружили, что неспособность к развитию яиц, отложенных самками о/о, можно преодолеть, если вскоре после оплодотворения ввести в них цитоплазму нормальных яиц. Результаты, полученные Бриггсом и Джастусом (Justus), показывают, что корректирующий фактор, отсутствующий в неполноценных яйцах, представляет собой белок.
В ряде исследований, в которых в яйца вводили белки, было твердо установлено, что некоторые белки легко проникают в ядра. Такие белки могут оказывать влияние на поведение ядра, как это обнаружили Бенбау и Форд (Benbow, Ford), которым удалось индуцировать синтез ДНК в ядрах, обрабатывая изолированные ядра лягушек белком, выделенным из цитоплазмы яиц и зародышей.
Становление локализации и пространственной организации
Во время оогенеза происходит чрезвычайно активная транскрипция генов и накопление ооцитами мРНК. Накапливающиеся в ооцитах мРНК столь разнообразны по своим последовательностям, что, как только после начала развития зародыша мРНК приступают к синтезу белков, с этих матриц могут транслироваться буквально тысячи видов различных белков. В наиболее хорошо изученном случае - у морского ежа - белковый синтез протекает очень вяло в неоплодотворенном яйце, но резко возрастает через несколько минут после оплодотворения. Это начальное усиление белкового синтеза (в сущности, весь белковый синтез), во всяком случае до наступления стадии бластулы, обеспечивает мРНК, синтезируемая во время оогенеза. Как корректирующий белок, устраняющий воздействие аллеля о у аксолотля, так и полярная плазма дрозофилы, обсуждавшаяся выше, обнаружены уже в ооцитах. Бриггс (Briggs) установил, что корректирующий белок синтезируется во время оогенеза и что его можно обнаружить в активной форме в самом начале этого процесса. Илмензе и его сотрудники предприняли поиски активной полярной плазмы в ооцитах дрозофилы. При помощи электронного микроскопа они сумели идентифицировать полярные гранулы на заднем полюсе ооцита в середине процесса вителлогенеза, т. е. во время максимального накопления желтка, но функциональную полярную плазму удается выявить лишь на поздних стадиях созревания ооцитов. Поэтому Илмензе и его сотрудники высказали мнение, что, хотя полярные гранулы, появляющиеся во время вителлогенеза, морфологически сходны с полярными гранулами яиц, они представляют собой, возможно, матрикс, к которому затем прикрепляются функциональные компоненты. Наконец, Домен и Вердонк (Dohmen, Verdonk) выявили на такой ранней стадии оогенеза, как вителлогенез, богатые РНК структуры, сходные с теми, которые позднее появляются в полярных лопастях брюхоногих моллюсков.
Таким образом, почти несомненно, что в яйцах детерминанты накапливаются во время оогенеза. Однако вопрос о том, когда эти материалы локализуются там, где им предстоит функционировать, остается открытым. В модели локализации, изображенной на рис. 4-3, сделано упрощающее допущение, что характер локализации уже установлен в яйце еще до того, как начинается дробление. В некоторых случаях это действительно так, но в других изменения локализации продолжаются и, возможно, завершаются лишь после того, как дробление зашло уже достаточно далеко.
Классическим примером событий, связанных с цитоплазматической локализацией, которые инициируются оплодотворением, служит перемещение пигментных гранул у асцидий Cynthia (Styela) partita, описанное Конклином (Conklin) в 1905 г. Последовательные перемещения цитоплазмы, происходящие после оплодотворения, показаны на рис. 4-8, взятом из этой статьи. Неоплодотворенное яйцо имеет равномерную сероватую окраску, но почти сразу же после проникновения в него сперматозоида начинается быстрая реорганизация цитоплазмы. Наиболее впечатляющее изменение - это быстрое перетекание желтых гранул к вегетативному полюсу яйца. Затем этот желтый материал постепенно распространяется в стороны от вегетативного полюса, пока не покроет все вегетативное полушарие. При перемещении ядра сперматозоида к одной стороне вегетативного конца за ним увлекается значительная часть желтого материала, из которого образуется желтый серп. Локализация желтого серпа, определяемая перемещением ядра сперматозоида и связанной с ним звезды, обозначает местоположение заднего конца развивающегося зародыша. Другие материалы цитоплазмы также занимают определенное место, так что ко времени первого дробления яйцо содержит четко выраженный желтый серп (3), темно-серый желток (4) и участки прозрачной цитоплазмы (5), а также три менее четко различимых окрашенных участка. Локализация всех этих веществ указывает на то, что судьбы участков, в которых они содержатся, предопределены; так, из материала желтого серпа образуются только мышечные клетки головастикоподобной личинки, темно-серый материал дает энтодерму, а прозрачная цитоплазма - эктодерму. Это, конечно, не означает, что детерминантами являются сами окрашенные материалы: просто они служат хорошо различимыми индикаторами перемещений цитоплазмы, определяющих локализацию детерминантов.
Рис. 4-8. Становление цитоплазматической локализации у зародыша асцидии Styela partita (Conklin, 1905). А. Яйцо с еще интактным зародышевым пузырьком (1). Б. Разрушение зародышевого пузырька и перемещение цитоплазмы. В и Г. Зародыш на стадии двух бластомеров (в двух разных ракурсах) с хорошо выраженным желтым серпом. Д. Стадия 8 бластомеров. Е. Ранняя личинка, у которой материал желтого серпа сосредоточен вокруг мышечных клеток хвоста (6).
