Рис. 4-9. Правосторонняя или левосторонняя закрученность раковины у прудовика Limnaea peregra как следствие направления спирального дробления на ранних стадиях развития (Morgan, 1927).
Детерминация симметрии закручивания у Limnaea служит примером того, как довольно резкий сдвиг морфогенеза - решение о формировании право- или левозакрученной раковины - определяется действием одного гена во время образования яйца. Кроме того, очевидно, что этот ген оказывает действие на компоненты матрикса цитоскелета. Цитоскелет - это динамичное трехмерное переплетение нитевидных элементов, ответственных за перемещения материалов внутри клетки и за изменения формы клетки, т.е. за процессы, играющие решающую роль в характере локализации-разметке раннего зародыша. Среди элементов цитоскелета преобладают структуры двух типов. Первые, микротрубочки, - это длинные полые трубочки диаметром около 25 нм, состоящие из родственных белков-тубулинов. Наиболее хорошо известны микротрубочки, образующие нити веретена, которые обеспечивают перемещения хромосом при митозе. Но микротрубочки образуют также и другие совокупности компонентов в цитоплазме. Второй основной класс нитевидных элементов составляют микрофиламенты; это прочные нити диаметром около 5 нм, состоящие из актина - одного из главных компонентов мышечных клеток. Сложные переплетения микротрубочек и микрофиламентов в цитоплазме клеток, выращенных в культуре, изображены на рис. 4-10. Эти клетки были выращены на предметных стеклах, зафиксированы формальдегидом, а затем обработаны антителами, специфичными к актину или тубулину. Связавшиеся антитела делают флуоресцентными и исследуют в УФ-микроскопе в темном поле. Совокупности микротрубочек и микрофиламентов хорошо различаются по внешнему виду, локализации и ориентации.
Рис. 4-10. Расположение микротрубочек в клетках мышей из культуры ткани, выявляемое методом непрямой иммунофлуоресценции с антителами, специфичными к тубулину. A. Сеть микротрубочек в цитоплазме интерфазной клетки. Б. Клетка после обработки колхицином, разрушающим микротрубочки. Обратите внимание, что на микрофотографиях А и Б видно, что структуры, организующие микротрубочки, примыкают к ядру. B. Делящаяся клетка, в которой видны микротрубочки, образующие звезды и веретено (Osborn, Weber, 1976).
Распределение основного вещества цитоскелета регулируется как в пространстве, так и во времени. Сборка микротрубочек зависит от наличия центров нуклеации (организации), которые определяют местоположение пучков трубочек, и от других пока еще недостаточно хорошо установленных регуляторов, определяющих сроки этого процесса. У Limnaea выявлена генетическая регуляция местоположения центров нуклеации, хотя следует отметить, что даже и в этом случае имеются некоторые осложняющие обстоятельства. Фримену удалось вызвать реверсию действия аллеля, детерминирующего закручивание раковины влево, вводя в яйца, отложенные материнскими особями, гомозиготными по аллелю левозакрученности, цитоплазму из яиц, дающих правозакрученные раковины. Эксперименты противоположного типа не приводят к изменению типа симметрии. Можно предполагать, что у Limnaea местоположение центров нуклеации или функциональный выбор между ними регулируется каким-то растворимым компонентом яйца.
Осборн и Вебер (Osborn, Weber) непосредственно наблюдали за центрами организации трубочек в клетках из культуры ткани, применяя метод флуоресцирующих антител. Как видно на рис. 4-10, это цилиндрическая полярная структура, содержащая тубулин и расположенная по соседству с ядром. Каждая клетка, по-видимому, содержит одну или две таких структуры. Легче всего их увидеть, если уничтожить микротрубочки, обработав клетку перед фиксацией колхицином или подвергнув ее действию низких температур. Восстановление микротрубочек после созревания клеток или удаления колхицина начинается в организационном центре, причем микротрубочки растут с одного конца организационного центра и радиально распространяются к краям клетки. Харрис, Осборн и Вебер при помощи того же метода флуоресцирующих антител наблюдали в яйцах морского ежа микротрубочки, образующие веретено и звезды, а также любопытное временное спиральное расположение микротрубочек в кортексе зиготы.
Микрофиламенты, подобно микротрубочкам, несут определенные функции, связанные с процессами локализации детерминантов в зародышах. Микрофиламенты нередко принимают участие в изменении формы клетки: сократимость представляет собой основное свойство входящего в их состав белка актина. Так, например, микрофиламенты обеспечивают цитокинез при дроблении. К концу митоза под клеточной мембраной, в плоскости метафазной пластинки, микрофиламенты образуют кольцо, которое, сжимаясь, отделяет две дочерние клетки одну от другой. Рэфф (R. Raff), а также Конрад (Conrad) и его сотрудники показали, что подобным же образом микрофиламенты вызывают сужение шейки полярной лопасти у моллюсков, принимая тем самым непосредственное участие в определении локализации. Местоположение микрофиламентов частично зависит от расположения пучков микротрубочек. Центры, организующие микротрубочки, обнаружены в яйцах и зародышах, однако, как это ясно видно из недавнего обзора Э. Рэфф (Е. С. Raff), регуляция их местоположения продолжает оставаться главной и нерешенной проблемой.
Местоположение организационных центров в зародышах хотя бы частично контролируется генами, однако на него оказывают влияние и другие факторы. Например, у амфибий место проникновения сперматозоида в яйцо определяет плоскость первого дробления и устанавливает дорсо-вентральную ось зародыша. Как показали недавние исследования Киршнера (Kirschner) и его сотрудников, инициация локализационных перемещений событиями, происходящими при оплодотворении, по-видимому, процесс сложный. Это (вместе с обсуждавшимися выше зависимостями между локализацией детерминантов и дроблением) указывает на то, что окончательная их локализация зависит как от организации яйца во время оогенеза, так и от событий, приводимых в движение оплодотворением.
Эволюционные изменения в организации яиц со спиральным дроблением
Для многих зародышей со спиральным дроблением, в особенности для зародышей моллюсков и кольчецов, составлены очень точные карты, на которых указана дальнейшая судьба различных клеток. Разные типы дробления и различия в размерах между бластомерами дают возможность проследить за судьбой отдельных бластомеров зародышей со спиральным дроблением в процессе развития. Эта их особенность в сочетании с высокомозаичным характером их развития сделала таких зародышей излюбленным объектом изучения эмбриологов.
Схема спирального дробления представлена на рис. 4-2, где изображены первые несколько делений. В результате второго деления образуются четыре бластомера - А, В, С и D. При третьем неравномерном делении образуется первый квартет микромеров. Им даны обозначения 1a, 1b, 1с и 1d, а соответствующим макромерам - 1А, 1В, 1C и 1D. Митотические веретена ориентированы таким образом, что макромеры и микромеры, возникшие в результате этого и последующих делений, расположены друг относительно друга по спирали.
При следующем делении, приводящем к 16 клеткам, микромеры первого квартета делятся равномерно, образуя 8 микромеров первого ряда. Макромеры делятся неравномерно, образуя второй квартет микромеров, обозначаемых 2а, 2b, 2с и 2d, и соответствующие макромеры. По мере дальнейшего развития как микромеры, так и макромеры продолжают делиться. Разработана специальная номенклатура для обозначения сложной системы образующихся при этом клеток, но для наших целей достаточно рассмотреть лишь общее расположение рядов микромеров при спиральном дроблении, изображенное на рис. 4-11, I. На этой упрощенной схеме показано только по четыре клетки каждого ряда. У настоящего зародыша в некоторых рядах будет, конечно, больше чем по четыре клетки вследствие продолжающегося дробления микромеров. Как на этой, так и на других сходных схемах, приведенных в данном разделе, многие детали опущены и рассматриваемые зародыши изображены лишь в общих чертах.
На рис. 4-11 показана типичная судьба различных бластомеров у зародышей Spiralia. Первые три ряда микромеров (не заштрихованы) образуют эктодерму зародыша и некоторые эктодермальные структуры; клетка, покрытая точками (4d), дает начало мезодерме; из макромеров (заштрихованы) развивается энтодерма - презумптивная средняя кишка. Подобный набор клеточных линий удивительно постоянен для всех зародышей Spiralia: у многоветвистых плоских червей, у кольчецов, а также у брюхоногих и двустворчатых моллюсков спиральное дробление протекает в основном одинаково, и судьбу клеток в этих группах можно непосредственно сопоставлять.
