Ознакомительная версия.
Разработка технологии, позволяющей заставлять бактериальную клетку вырабатывать в больших количествах любой белок, ознаменовала начало нового этапа научно-технической революции – эры биотехнологии.
Но прежде всего эта новая технология произвела переворот в самих молекулярно-биологических исследованиях. Дело в том, что каждый конкретный белок производится клеткой, как правило, в очень малом числе, нередко всего по одной или две молекуле на клетку. В результате выделение индивидуального белка, нужного для экспериментов, превращается в труднейшую и весьма дорогую процедуру. Чтобы получить миллиграммы белка, приходится перерабатывать десятки килограммов, если не тонны, биомассы. Но все равно очистить как следует белок, когда он присутствует в столь малой концентрации, не удается. Отсюда – чрезвычайная дороговизна многих белковых препаратов и их недостаточная чистота.
Генная инженерия радикально изменила ситуацию. С использованием этого метода получены в чистом виде штаммы – суперпродуценты многих белков, о чем ранее можно было только мечтать. Резко расширился ассортимент и упали цены на ферментные и другие белковые препараты, выпускаемые фирмами, обслуживающими молекулярно-биологические исследования. Невиданно ускорились научные исследования. Молекулярная биология получила новый мощный импульс для своего развития.
Постепенно возникла новая прикладная дисциплина – синтетическая биология. Исследователи стали вставлять в геном микроба целые кассеты генов, кодирующих ферменты с таким расчетом, чтобы эти ферменты осуществляли последовательную цепь превращений исходного химического соединения, введенного в ферментер, где размножается микроб. Так удается нарабатывать в огромных количествах сложнейшие молекулы.
Пожалуй, наиболее важная работа такого рода была выполнена группой Джэя Кислинга в Беркли. Этой группой был создан штамм дрожжей – суперпродуцент очень эффективного лекарства от малярии – артемисинина. Это лекарство в виде экстракта из сладкой полыни испокон веков использовалось в китайской медицине, но в чистом виде было впервые выделено только в 70-х годах ХХ века исследовательницей из Китайской Народной Республики Ту Юю. В 2015 году Ту Юю была удостоена Нобелевской премии по физиологии и медицине. Однако до недавнего времени, особенно в годы неурожая полыни, наблюдалась острая нехватка артемисинина. Теперь ситуация коренным образом изменилась. Начиная с весны 2013 года артемисинин производится на заводе в Италии в больших количествах микробиологическим способом с использованием дрожжевого штамма, разработанного Кислингом.
К концу 1960-х годов в молекулярной биологии сложилась парадоксальная ситуация. К тому времени были довольно хорошо разработаны методы определения последовательности аминокислот в белках (первый белок, инсулин, был расшифрован Фредериком Сэнгером еще в самом начале 1950-х годов). Банк белковых последовательностей довольно быстро пополнялся все новыми текстами. Был полностью расшифрован генетический код – словарь для перевода ДНКовых текстов на белковый язык. Но вот парадокс: не было прочитано ни одного ДНКового текста!
Конечно, куски текста можно было попытаться прочесть, так сказать, обратным ходом, исходя из белковых последовательностей. Но, во-первых, такое восстановление неоднозначно из-за вырожденности кода, а во-вторых, и это самое главное, так не узнаешь, что стоит в промежутках между генами. А как раз генетические знаки препинания казались самым интересным, ведь это должны были быть регуляторные участки, управляющие работой РНК-полимераз и других белков, взаимодействующих с ДНК.
Фактически решение всех насущных вопросов молекулярной биологии уперлось в необходимость уметь читать последовательности ДНК. Как уже знает читатель, главной палочкой-выручалочкой, выведшей молекулярную биологию из состояния застоя, были рестриктазы. Они не только позволяли тасовать гены, но и сделали реальным определение последовательности нуклеотидов в ДНК. Ведь главная трудность заключалась в том, что молекулы ДНК очень длинные. Рестриктазы позволили разрезать длинные молекулы на достаточно короткие куски. Но оставалось решить еще две проблемы: научиться разделять фрагменты и определять последовательность в каждом из них.
На помощь пришла простая физическая методика, называемая электрофорезом. Молекула ДНК несет на себе отрицательный заряд, причем величина заряда пропорциональна длине цепочки. Это следствие обычной электролитической диссоциации дезоксирибонуклеиновой кислоты, которая, как и любая кислота, распадается на анион и ион водорода. Только происходит это в каждом мономерном звене поликислоты. Конечно, каждому отрицательному заряду фосфатной группы ДНК соответствует положительный заряд катиона. Обычно это ион натрия, а вовсе не водорода, так как, хотя ДНК и называют кислотой, на самом деле она всегда – соль. Так что буква «К» в знаменитом сокращении «ДНК» – это плод чистейшего недоразумения. Ведь никто не называет поваренную соль соляной кислотой! Но ничего не попишешь – название укоренилось навеки. Придется нам и далее называть соль ДНК просто ДНК.
Катионы в большинстве своем не сидят на ДНК, а плавают отдельно в растворе, образуя вокруг молекулы очень рыхлое облако. Поэтому если раствор ДНК поместить в конденсатор, то анион ДНК поплывет к положительной обкладке. Чем длиннее молекула, тем больше заряд, больше сила, но больше и сопротивление среды. Если сопротивление увеличивается с длиной иначе, чем сила, то в результате скорость будет зависеть от длины. Тут работает закон Стокса, согласно которому в вязкой среде тела под действием силы движутся с постоянной скоростью, пропорциональной приложенной силе.
Таким образом, поместив в электрическое поле смесь, состоящую из фрагментов ДНК разной длины и выключив через некоторое время поле, мы обнаружим, что наша смесь распалась на несколько скоплений фрагментов, причем в каждом таком скоплении все молекулы будут иметь строго одинаковую длину. Это произойдет потому, что фрагменты разной длины сместятся за данное время в поле на разные расстояния от исходной точки, а одинаковые – на одно и то же расстояние. Правда, если на самом деле все это проделать, то разделения молекул по их длине добиться не удастся. Получается, что электрофорез – никуда не годный метод разделения ДНК. Так думали долгое время. Все же выход был найден.
Из повседневного опыта мы знаем, что существуют вещества вроде бы жидкие, но долго сохраняющие приданную им форму. Это – студни, желе. В науке и технике за ними закрепилось название «гели». Что же они собой представляют, эти гели, и чем обусловлены их необычные свойства?
Гель – это концентрированный раствор полимера, в котором полимерные молекулы сильно перепутаны, а кое-где сшиты друг с другом химическими связями. В результате весь гель пронизывает единая трехмерная полимерная сеть, ячейки которой заполнены растворителем. Эта сеть служит как бы арматурой, придающей всей конструкции необычную для жидкости жесткость. Полимерная арматура составляет по массе ничтожную часть всего геля – несколько процентов. Основная масса геля приходится на растворитель. Способность переходить в гелеобразное состояние – одно из поразительных свойств макромолекул, которое еще ждет своего всестороннего изучения и технических применений.
Живая природа широко использует замечательные свойства гелей. Роговая оболочка и стекловидное тело, заполняющее всю внутреннюю часть глаза, есть не что иное, как гели. Полимерным компонентом служат белки, растворителем, разумеется, – вода. Издавна гели используются человеком в кулинарном деле. Студни и желе содержат в качестве полимерного компонента белок соединительной ткани – коллаген. Пожалуй, еще чаще мы сталкиваемся с другим белковым гелем – сваренным вкрутую (или всмятку) яичным белком. Мармелад – это тоже гель.
Использование геля как среды, где проводится электрофорез, позволило решить проблему разделения фрагментов ДНК. Червеобразные молекулы ДНК, подобно угрям, или змеям, запутавшимся в рыбацкой сети, медленно ползут, извиваясь, к аноду, едва протискиваясь сквозь тесные ячейки. Чем длиннее молекула, тем медленнее она ползет. Такое змееобразное движение молекулы ДНК называют рептационным. Зависимость силы сопротивления среды от длины ДНК в случае рептационного движения гораздо сильнее, чем зависимость от длины ДНК силы электрического поля при электрофорезе, в отличие от случая движения в растворе, когда эти две зависимости одинаковые. В результате при электрофорезе в геле молекулы ДНК разной длины разделяются очень хорошо. Идея рептационного движения длинных молекул в полимерных сетках, которая легла в основу теоретического объяснения поведения ДНК при электрофорезе в геле, была выдвинута выдающимся французским физиком Пьером Жилем де Женом, который был удостоен Нобелевской премии по физике за 1991 год.
Ознакомительная версия.
