к фагу, если в его ДНК в район CRISPR попадает кусочек этого бактериофага и в бактерии активен ген Cas9. В 2007 году появилась работа, в которой было экспериментально показано, что наличие у бактерий кусочков вирусного генетического текста означает, что изучаемые бактерии были когда-то инфицированы этими вирусами и приобрели к ним иммунитет.
Прежде, до этого открытия, считалось, что адаптивный иммунитет присущ только высшим организмам, в том числе человеку. Благодаря его наличию, человек приспосабливается к окружающему миру в том смысле, что если он один раз встретился с некой инфекцией, то потом может стать к ней устойчивым. Многочисленные вакцины, которые, на наше счастье, снизили смертность от инфекционных заболеваний и тем самым увеличили среднюю продолжительность человеческой жизни лет на тридцать, как раз и связаны с адаптивным иммунитетом.
Как работает иммунитет
В отличие от бактерии, человек является многоклеточным организмом, в котором имеются различные ткани и есть системы органов, объединяющие различные ткани (опорно-двигательная, кровеносная и нервная системы), поэтому адаптивный иммунный ответ, функционирующий у человека, крайне сложен. Он основан на том, что распространение инфекции в сложно устроенном многоклеточном организме требует достаточно длительного времени — часов, а то и дней. Даже для вируса, который очень быстро распространяется по кровотоку, прохождение по кругу кровообращения все равно занимает пару десятков минут, а ведь ему еще надо проникнуть в клетки, которых в человеке 1014, чтобы инфицировать их.
Природа позаботилась о том, чтобы при попадании инфекции в организм он был всегда готов к ответу, стоял на страже своего здоровья. Происходит это так. Иммунной системой постоянно продуцируются различные варианты либо антител, либо клеток с распознающими рецепторами, которые путешествуют по нашему телу. Их вариантов существует множество, ведь неизвестно, с каким патогеном произойдет встреча, и они должны быть «заготовлены» чуть ли не на любой случай.
А дальше две возможности. Если за цикл путешествия по организму антитело или клетка с распознающим рецептором не встретили партнера по взаимодействию (бактерию, вирус или еще какого-нибудь врага), то они потом уничтожаются самим организмом, погибает клетка, продуцирующая данный вариант антитела или распознающего рецептора. Но если один из этих стражей встретил свою мишень, к которой он подходит, как ключ к замку, то клетка, которая произвела данное антитело или распознающий рецептор, не погибает, а начинает пролиферировать, то есть активно размножаться, чтобы своими «ключами» уничтожать все эти «замки».
Этот процесс, в котором осуществляется сложное клеточно-белковое взаимодействие, происходит постоянно. Беспрестанно генерируются миллионы B-лимфоцитов, вырабатывающих всевозможные антитела, и T-лимфоцитов, которые продуцируют клеточные рецепторы, распознающие чужеродные молекулы. Эти миллионы наших защитников все время погибают; только единицы из них, если человек инфицирован, встречаются со своими «половинками», «мишенями», которых они распознали. Таким образом, наш многоклеточный организм позволяет себе иметь ненужные в данный момент молекулы и клетки, которые массово производятся и уничтожаются при неиспользовании. Но бактерия — это всего одна клетка, все происходит на одной крохотной площадке. Обязанность бактерии — делиться каждые двадцать минут; как, например, это делает Esherichia coli, кишечная палочка — у нее не хватит энергии на то, что запросто делает многоклеточный организм, кидающий в себя ежедневно два килограмма пищи. У бактерии должны быть более простые и быстрые варианты защиты от той или иной внешней инфекции, в частности от бактериофагов.
Дальнейшие исследования детально объяснили, каким образом функционирует адаптивный иммунитет бактерии. Оказалось, что он, как и у человека, изначально работает случайным образом. К примеру, в бактериальную клетку проникает чужеродная ДНК бактериофага или плазмиды. Единственное, чем может бактериальная клетка защититься от проникшей в нее чужеродной ДНК, пока еще нет иммунитета, — это расщепить врага, уничтожить целостность генетической информации, то есть порезать ее на маленькие кусочки. Как только клетке удалось разрезать ДНК бактериофага в каком-то месте (а лучше в двух или даже трех местах), молекула вирусной ДНК становится нефункциональной и нанести вред клетке уже не может.
Но кусочки, на которые клетка расщепила ДНК бактериофага, не пропадают просто так. Они встраиваются в определенный район генома самой бактерии, который мы как раз и назвали CRISPR.
Итак, та бактерия, которой счастливо удалось избежать гибели от бактериофага и встроить крошечные кусочки его ДНК (короткие фрагменты по десять-пятнадцать нуклеотидов) в свой геном, получает устойчивость к данному бактериофагу и при делении передает эту устойчивость по наследству.
После того как кусочки ДНК бактериофага попали в CRISPR-район ДНК бактерии, эта бактерия начинает делать почти то же самое, что и многоклеточный организм: со своего CRISPR-района с чужеродными фрагментами она все время транскрибирует последовательности в виде коротких молекул РНК, которые когда-то пришли в бактериальный геном от вируса. Но присутствуют они не просто так, а уже вместе с нуклеазой Cas9.
Рассмотрим теперь, что происходит при повторном инфицировании этой бактерии тем же самым бактериофагом, кусочки которого в ней имеются. Если в бактерию проникла ДНК бактериофага, то короткая РНК способна связаться с комплементарным участком ДНК этого бактериофага, ведь она когда-то от него и произошла. И как только она это сделала, фермент Cas9, то есть нуклеаза, связанная с молекулой РНК, тут же расщепляет ДНК бактериофага и убивает врага (см. рис.7).
Эту короткую молекулу РНК, которая распознает определенный кусок генетического текста бактериофага и направляет нуклеазу на чужеродную ДНК, называют направляющей (guided) РНК.
Рис. 7. Работа CRISPR системы
ЧТО ЖЕ СЛУЧИЛОСЬ С DANONE
Мы рассмотрели, как у бактерии функционирует иммунная система, и стало понятно, что за беда приключилось у компании Danone. Обычная технология, когда в молочную массу добавляли бактериофаги, чтобы удалить посторонние бактерии, не сработала, продукты выходили испорченными. Такой результат получился оттого, что сотрудники компании регулярно применяли свои бактериофаги на одних и тех же штаммах бактерий, которые в конце концов приобрели устойчивость к данным вирусам, стали нечувствительны к ним. А это значит, что бактерии приобрели адаптивный иммунитет, но совершенно другим способом, чем человек, — без всяких антител.
Следующим важным открытием стало то, что система CRISPR/Cas9 уже известной нам бактерии Streptococcus thermophilus может эффективно работать в
