и определенная температура — тридцать семь градусов Цельсия, поскольку именно при этой температуре живут наши клетки. Больше ничего не нужно. Поэтому длительность побуквенного редактирования генома сократилась от шести месяцев до десяти—четырнадцати дней. Просто, дешево и быстро! Благодаря этому, система CRISPR/Cas9 произвела революцию в современных технологиях генной инженерии.
Оттачиваем инструменты
После того как были открыты первые виды микроорганизмов, имеющих адаптивный иммунитет к бактериофагам, ученые стали искать и другие виды бактерий, тоже имеющих подобную систему защиты, и обнаружили их достаточно много. Отчасти эта активность была обусловлена стремлением запатентовать новые типы нуклеаз или принципы функционирования направляющей РНК для последующей возможной коммерциализации, но, как мы видели на примере йогуртов Danone, даже тот интерес, за который платят деньги, быстро приводит к новым научным открытиям и технологическим прорывам.
Системы CRISPR и ферменты, сходные с Cas9-нуклеазой, были обнаружены у очень многих видов бактерий. Оказалось, что они обладают несколько различающимися свойствами в плане распознавания коротких нуклеотидных последовательностей. Это важно, потому что, как мы помним, у человека в геноме три миллиарда букв, и если мы хотим как-то отредактировать генетический текст, резать надо очень точно и в строго определенном месте, то есть необходима специфичность разрезания. Например, если в случае использования CRISPR стрептококка для распознавания посредством направляющей РНК особенно важны только первые три нуклеотида, то в случае стафилококка уже требуется последовательность, в которой особенно важны первые шесть нуклеотидов. Среди трех миллиардов букв генома человека комбинация из трех нуклеотидов еще может найтись, но найти вторую такую же комбинацию из шести нуклеотидов направляющая РНК и фермент Cas9-нуклеаза едва ли сумеют, поэтому специфичность распознавания и точность разрезания будут намного выше.
Помимо поиска новых CRISPR-систем и Cas9-нуклеаз в различных бактериальных штаммах, люди, овладевшие навыками генной инженерии, сами пытаются тем или иным способом изменить, усовершенствовать эти ферменты под собственные нужды. И это на самом деле возможно, потому что если мы имеем какой-то фермент — скажем, нуклеазу, — то знаем, конечно, его структуру и можем постараться внести туда те или иные модификации, чтобы получить фермент с другими свойствами.
Например, первоначально Cas9-нуклеазы обладали такой активностью, что происходило разрезание обеих цепей ДНК. Это очень ценное качество, но исследователи решили попробовать сделать по-другому, и были получены модифицированные варианты этих ферментов, которые могли разрезать только одну нить ДНК. Почему это хорошо? Опять-таки, для повышения точности! Если мы в одной цепи ДНК делаем разрыв в одном месте, а в другой цепи — со сдвигом, скажем, на десять нуклеотидов в сторону, то направленность и точность распознавания сильно повышается, и единственный на весь геном разрез будет именно в этом месте. Бывают случаи, когда это совершенно необходимо.
Возможны и другие модификации. В частности, варьируя нуклеазную активность фермента, мы можем даже просто ее «убить», чтобы этот фермент совсем не имел нуклеазной активности. Тогда в клетке будет происходить высокоспецифичное распознавание, но никакого разрезания ДНК не произойдет вообще.
Конечно, надо честно признаться, что не все в обсуждаемом нами методе так идеально. Хотя исследователи исходят из того, что направляющая РНК осуществляет строго направленное воздействие и способна распознавать конкретные буквы генетического текста, всегда остается опасение, что случайным образом молекула ДНК может быть где-то разрезана еще и будет нарушена целостность генома. Это явление называется off-target, или внемишенный эффект. Поэтому для биомедицинских целей все усилия исследователей в использовании данного метода направлены на то, чтобы максимально повысить специфичность распознавания.
Это объясняет, зачем нужны модифицированные нуклеазы, которые распознают одну цепь. Чтобы с их помощью произвести двухцепочечный разрез, надо использовать две направляющие РНК к двум фрагментам генетического текста, и это повышает точность, а значит, уменьшает внемишенный эффект. Избегать таких эффектов — очень важная составляющая работы в области биологии и медицины, потому что главное — это все-таки безопасность для человека.
С тех пор как основным инструментом геномного редактирования стала система CRISPR/Cas9, в мире наблюдается взрывной интерес к ее применению в фундаментальной науке и множестве практических приложений. Создан целый ряд компаний, занятых редактированием геномов растений и модификацией животных. Существуют компании, работающие в области биомедицины, чтобы использовать эти же технологии в здравоохранении.
Во многих отношениях применение CRISPR/Cas9 сталкивается с теми же трудностями, что и другие сконструированные нуклеазы: это не всегда высокая эффективность разрезания ДНК, недостаточная специфичность есть проблемы с доставкой фермента в нужные клетки, а также возможность иммунной реакции (поскольку все нуклеазы содержат элементы, полученные от бактерий) и сложность оценки конечного результата. Но есть и одно громадное преимущество — простота использования по сравнению со всеми предшествующими инструментами редактирования генома.
Многие ученые внесли свой вклад в замечательные открытия, о которых мы говорили в этой главе. Но высшая награда, Нобелевская премия по химии за 2020 год, была присуждена двум выдающимся женщинам-исследователям — Дженнифер Дудна и Эмманюэль Шарпантье, которые сначала участвовали в открытии адаптивного иммунитета бактерий, а потом вместе с коллегами занимались разработкой технологии CRISPR/ Cas9.
