Что касается Пруссии, она была потеряна для ордена уже в 1525 г. Герцог Альбрехт в 1526 г. женился на принцессе Анне-Доротее, дочери короля Дании. Их сын Альбрехт Фридрих (1568-1618) был вторым герцогом Пруссии, но ввиду его умственной отсталости управление герцогством было доверено старшему члену семьи Гогенцоллернов, представленной границами-курфюрстами Брандебургскими. После смерти Альбрехта-Фридриха, курфюрст Иоганн-Сигизмунд (1572-1619), женатый на дочери герцога Альбрехта, объединил под своей властью Бранденбург и восточную Пруссию, что считается началом создания прусского государства. В 1701 г. оно стало называться королевством Пруссия, которым Гогенцоллерны правили до ноября 1918 г.
Магистры ордена никогда не отказывались от Пруссии и неустанно просили у императора помощи, чтобы возвратить свои владения. Магистр Кронберг умер, у ордена не осталось ни малейшей надежды добиться справедливости. Его преемник не хотел сдаваться и заручился обещаниями Карла V. Письма инвеституры, полученные императором на следующий день после избрания великого магистра, подтверждали обоснованность требований тевтонских рыцарей: действительно, император приказал всем принцам империи оказывать помощь магистру в возвращении имущества ордена, отобранного герцогом Пруссии. Но на самом деле проблема была не только делом немцев, она касалась также Польши, так как с 1525 г. герцогство Пруссии стало вотчиной Короны. Отказался принимать свершившийся факт и магистр Георг фон Венкхайм (1566-1572), а также все его преемники.
Но Пруссия и Ливония не были единственными провинциями, подчиненными Тевтонскому ордену, которые примкнули к Реформации. Многочисленные немецкие княжества стали протестантскими, а в этом случае сохранять на их территории религиозный орден, верный Риму, не имело смысла. Принцы, вельможи, городские власти, примкнувшие к Реформации, проявляли большой интерес к имуществу Церкви и религиозных орденов. Протестантская Реформации восторжествовала в Саксонии, Тюрингии, Гессене, Голландии, т. е. в тех регионах, где Тевтонский орден имел значительные владения. В этих регионах одна часть братьев ордена, в основном рыцари, перевели имущество из церковного владения в светское, другая часть, в основном братья-священники, оставшиеся верными Риму, была изгнана. Рыцари, присоединившись к Реформации, считали возможным оставаться членами Тевтонского ордена. Это создавало запутанное юридическое положение, а именно: существование внутри Тевтонского ордена рыцарей-протестантов, не признанных Римом, но которых терпел великий магистр. Что и произошло в Саксонии. Зато в Тюрингии ландграф приступил к секуляризации всех командорств, принадлежащих ордену, подражая в этом другим протестантским сеньорам; в то же время он позволил существовать вотчине в Тюрингии и признал за магистром право назначать командора, лишь бы тот был протестантом. В Гессене сосуществовали тевтонские рыцари-протестанты и католики, представленные, независимо от их вероисповедания, в генеральном капитуле и принимающие участие в решении вопросов, касающихся ордена.
В Утрехте проблем почти не было вплоть до правления Филиппа II, но победа Реформации на севере Нидерландов привела к образованию нового протестантского государства — Объединенные Провинции Нидерландов. Великий командор Утрехта, Франц фон Лоэ, примкнул к Реформе в 1579 г., но его преемники-католики попытались сохранить орден в Голландии.
В 1615 г. правитель Утрехта сообщил великому командору Тьерри де Блуа, что тот должен выбрать помощника из числа протестантов. Тевтонские рыцари Утрехта отказались подчиниться этому требованию и после смерти великого командора избрали командором католика, Гаспара ван Линдена, который стал последним католическим командором Утрехта. В 1520 г. после смерти Гаспара ван Линдена правитель Утрехта назначил протестантского герцога Генриха фон Нассау великим командором; большая часть рыцарей приняла протестантство, Утрехт сохранил традиции ордена, но под протестантским знаменем.
В Священной империи, где католические и протестантские принцы сумели без вражды найти разумный компромисс, благодаря Аугсбургскому миру, положение Тевтонского ордена как на католических землях, так и на протестантских оказалось весьма неопределенным. Созданный, чтобы заботиться о раненых и больных в крестовых походах, а уже во вторую очередь чтобы принимать участие в войнах, которые вел христианский мир против неверных и язычников, Тевтонский орден, изгнанный из Святой земли сарацинами, а из Пруссии — протестантской ересью в раздробленную и ослабленную немецкую землю, был обречен на исчезновение. Количество братьев-рыцарей и братьев-священников постоянно сокращалось; множество командорств держалось ничтожно малым количеством рыцарей или было оставлено ими. Многие спрашивали друг друга, сохранилась ли у ордена та роль, которую ему надлежало играть в этом государстве на немецкой земле, последнем убежище тевтонских рыцарей, христиан, отныне воюющих с другими христианами. Кому нужен орден монахов-воинов?
В тот самый момент, когда Священная империя пыталась справиться с кризисом, спровоцированным учением Лютера, возникла новая опасность — на Востоке. После поражения короля Богемии и Венгрии Людовика II (Лайоша) в Мохаче 25 августа 1526 г. оттоманские турки заняли Венгрию, что создавало реальную угрозу для Священной империи, так как, с одной стороны, Венгрия граничила с австрийскими провинциям империи, а с другой стороны, потому, что член императорской семьи Фердинанд Габсбургский стал королем Венгрии.
Долгое время война в Венгрии сводилась к спорадическим стычкам, за которыми следовали длительные периоды перемирий, казалось, что целесообразно для защиты христианского мира, и, в первую очередь Священной империи, создать новый рыцарский орден, который смог бы объединить тевтонских рыцарей или то, что от них оставалось, и рыцарей Ордена Святого Иоанна Иерусалимского, т. е. ордена мальтийских рыцарей с тех пор, как Карл V в 1530 г. предоставил им в вотчину остров Мальта.
Этот проект, задуманный императором Максимилианом II (1564-1576), был представлен им Собранию в Регенсбурге 17 сентября 1576 г. Магистр Тевтонского ордена Генрих фон Бобенхаузен (1572-1590) приглашен не был. После смерти императора его преемник Рудольф II (1576-1612) по совету Карла фон Лихтенштайна вернулся к этому проекту и уточнил, что тевтонские рыцари как вознаграждение за свои услуги могли бы получить территории на юго-западе Венгрии, в регионе, примыкающем к Хорватии и Каринтии. Надо было еще получить согласие венгерского Собрания и Тевтонского ордена финансировать строительство крепостей на территориях, защита которых ему поручалось.
Посвященный в этот план магистр Бобенхаузен решил посоветоваться с генеральным капитулом ордена, который был созван 21 января 1577 г. Все командоры ордена, за исключением командора Утрехта, в общей сложности сто тридцать человек, приняли участие в этом капитуле. Магистр привел аргументы императора. Для Рудольф II турецкая угроза была реальной, и ввиду опасности, которую она представляла для восточных границ империи, затрат для их защиты, ему представлялось разумным, чтобы тевтонские рыцари возглавили защиту христианства, как они это сделали в других регионах в другие времена. Эмиссары Рудольфа II, присутствующие на капитуле, добавили, что провинции империи разорены и что император не в состоянии обеспечить защиту империи своими силами. Германию можно спасти, по их мнению, только если переселить в Венгрию Тевтонский орден и его рыцарей, где они могли бы обеспечить эффективную защиту христианского мира от нашествие ислама. Капитул ответил, что необходимо проконсультироваться с немецким дворянством и осведомиться о средствах, которыми располагают различные командорства ордена. Сразу же был отправлен запрос о наличествующих ресурсах. Открылось катастрофическое положение ордена в Германии. Там находилось всего сто девятнадцать братьев-рыцарей и пятьдесят два капеллана, в то время как в 1379 г. в той же провинции обитали соответственно семьсот один рыцарь и сто двадцать три капеллана. Орден не имел материальной возможности взвалить на себя столь тяжкий груз, так как доходы его упали в аналогичных пропорциях. Магистр твердо стоял на своем. В длинном письме от 15 апреля 1578 г., направленном императору, он напомнил, что орден желал бы помочь империи, но не в одиночку; он перечислил все утраты, понесенные орденом вследствие протестантской Реформы, и объявил о готовности пересмотреть свою позицию, если только принцы-электоры и сам император добьются восстановления их прав во всех владениях, которых лишился орден. Магистр приложил к своему списку отчет о материальном состоянии различных командорств, как это явствовало из результатов расследования, проведенного в 1577 г.
